Представлены оригинальные данные молекулярно-цитогенетического исследования частоты нерасхождения хромосом (дисомии) в половых клетках пациентов с нарушением сперматогенеза при нормальном кариотипе и при нарушении хромосом Представлены оригинальные данные молекулярно-цитогенетического исследования частоты нерасхождения хромосом (дисомии) в половых клетках пациентов с нарушением сперматогенеза при нормальном кариотипе и при нарушении хромосом (кариотип 46,ХУ,t (1;13); мозаицизм 47,ХХУ [6]/46,XY[94]; кариотип 47,XXY).
Ключевые слова:
нерасхождение хромосом, половые клетки, нарушение сперматогенеза, мужское бесплодие.
Дисомия по половым хромосомам (гоносомам) является одной из распространенных форм хромосомопатии (синдром Клайнфельтера, поли Y и др.) у пациентов с мужским бесплодием [1-5]. Одной из причин развития таких заболеваний является внесение в зиготу мужской или женской половой клеткой лишней гоносомы при оплодотворении. Исследование хромосомного набора в самих половых клетках позволяет составить представление о частоте и причинах возникновения дисомии (нерасхождении) хромосом в гаметах. Это, в свою очередь, будет способствовать разработке профилактических мероприятий с целью снижения уровня хромосомопатий, передаваемых через половые клетки родителей.
Цитогенетическое исследование гамет человека ограничено трудностью получения материала. Практически доступны для анализа лишь мужские половые клетки и то при показаниях к проведению биопсии яичка. Кроме того, анализ хромосом на материале биопсии яичка был возможен лишь на тех стадиях сперматогенеза, на которых хромосомы конденсированы и визуализируются: в сперматоцитах в пахитене, диакинезе-метафазе I и в метафазе II. В зрелых мужских гаметах-сперматозоидах хроматин конденсирован и не пригоден для традиционного цитогенетического исследования. Лишь с конца 70-х годов был разработан метод гетерологичного оплодотворения ооцитов золотистого хомячка сперматозоидами человека, позволивший визуализировать хромосомы сперматозоидов и анализировать их [6, 7]. C развитием молекулярно-цитогенетических методов стало возможным с помощью хромосомоспецифичных ДНК-зондов проводить анализ хромосом не только в метафазных, но и интерфазных клетках, в том числе и в половых на разных стадиях их развития [8-13, 24].
Материалы и методы
Определяли частоту нерасхождения хромосом (гоносом и некоторых аутосом) у 17 пациентов с нарушением сперматогенеза при нормальном кариотипе (2-я группа) и у 7 пациентов при аномальном кариотипе (3-я группа). В качестве контрольной (1-й) группы обследовали 37 мужчин с нормальной спермограммой и нормальным кариотипом. Молекулярно-цитогенетический анализ гамет проведен у 3 пациентов из этой группы.
В схему клинико-генетического обследования [5] входило традиционное спермиологическое исследование эякулята [15], количественный кариологический анализ незрелых половых клеток (НПК) из эякулята, цитогенетическое исследование лимфоцитов периферической крови, молекулярно-цитогенетическое исследование препаратов клеток эякулята [14].
Спермиологический анализ эякулята выполнялся дважды у большинства пациентов по методу, рекомендованному ВОЗ [15]. По результатам спермиологического анализа пациентов относили к одной из шести групп [15]. Суховоздушные препараты половых клеток из эякулята получали общепринятыми методами [16, 17] и окрашивали по методу Гимзы для проведения количественного анализа состава НПК по разработанному нами способу [18]. FISH-анализ на препаратах половых клеток из эякулята проводили по M.Guttenbach и соавт.[14]. В целях определения анеуплоидии в половых клетках как показателя нерасхождения хромосом в мейозе в 27 случаях были проведены молекулярно-цитогенетические исследования клеток эякулята. FISH проводили с использованием ДНК-проб, специфичных для гоносом (Х и Y) и аутосом (хромосомы 1, 4, 10, 13+21, 18). В исследовании применяли хромосомоспецифичные ДНК-пробы из оригинальной библиотеки, предоставленные Ю.Б. Юровым [19, 20]. Аутосомные ДНК-пробы применяли для оценки нерасхождения соответствующих хромосом в мейозе.
Результаты и обсуждение
У 3 пациентов с нормальным кариотипом и нормоспермией (1-я группа) не выявлено дисомии хромосом X, Y, по данным молекулярно-цитогенетического исследования гамет. У некоторых из обследованных нами 17 пациентов с нормальным кариотипом и нарушением сперматогенеза (2-я группа) выявлено увеличение числа дисомных гамет по сравнению с частотой дисомии в сперматозоидах у здоровых мужчин [10, 21]. Согласно данным [10, 21], уровень нерасхождения половых хромосом в сперматозоидах здоровых мужчин с нормальным кариотипом и спермограммой составляет 0,05-0,1%, а уровень нерасхождения аутосом — 0,04-0,4% (в зависимости от хромосомы) от общего числа подсчитанных клеток. У одного из пациентов с астенозооспермией, у которого молекулярно-цитогенетический анализ сперматозоидов и сперматид проводили дважды, на двух образцах эякулята, полученных с интервалом в 7 мес, в 1-м образце выявлена дисомия по хромосоме 1 в 36% сперматозоидов, во 2-м — в 57% сперматозоидов. У пациента с кариотипом 46,XY,t(1;13) и азооспермией на суховоздушных препаратах клеток эякулята выявлено лишь 10 сперматозоидов, в 3 из них определена дисомия хромосомы 1. Из 93 сперматид в 22 (около 24%) также определена дисомия хромосомы 1, в 1 сперматиде, а также в 1 из 148 проанализированных сперматоцитов выявлена трисомия по хромосоме 1. Возможно, что транслокация хромосом 13 и 1 у данного индивидуума является причиной нарушения расхождения хромосом в делениях созревания гамет и как следствие — дисомии по хромосоме 1 в сперматидах и сперматозоидах. Не исключено, что высока вероятность передачи лишней хромосомы при дисомии гамет потомству при использовании ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида). Поэтому в схеме клинического обследования следует проводить медико-генетическое консультирование пациента, молекулярно-цитогенетическое исследование гамет, преимплантационную и/или пренатальную диагностику плода на носительство хромосомной патологии [5].
Нами исследованы половые клетки 6 пациентов с синдромом Клайнфельтера (в одном случае — мозаичная форма). При молекулярно-цитогенетическом анализе частоты нерасхождения хромосомы Х в случае мозаицизма 47,XXY[94]/46,XY[6] дисомия выявлена в 43% сперматозоидов и сперматид, определены 3 гибридизационных сигнала и более в 22% клеток. У пациентов с кариотипом 47,XXY частота дисомии Х в сперматозоидах (если таковые выявлялись) и сперматидах колебалась от 6 до 40%. Столь высокую долю дисомии по хромосоме Х в гаметах пациентов с синдромом Клайнфельтера по сравнению с уровнем дисомии, в том числе по хромосоме Х, у мужчин с нормальным кариотипом и нормоспермией [10, 21] можно объяснить нарушением процесса конъюгации и затем — нерасхождения хромосом в мейозе у лиц с нарушением числа (как и у обследованных нами пациентов) или структуры хромосом в кариотипе. В принципе, и у индивидуумов с нормальным кариотипом в 20-25% сперматоцитов на стадии зиготены-пахитены происходит нарушение конъюгации хромосом, и такие клетки дегенерируют, что является физиологической селекцией на уровне гамет [22]. По-видимому, у пациентов с кариотипом 47,XXY высока частота нарушения мейоза на стадии зиготены-пахитены и лишь малая доля сперматоцитов завершает мейоз и переходит в сперматиды и сперматозоиды. Это подтверждается семиологическим исследованием состава НПК эякулята. Такая остановка процесса сперматогенеза приводит к интенсивной гибели половых клеток и может явиться причиной азоо- или олигозооспермии тяжелой степени. В литературе практически отсутствует информация относительно уровня хромосомных аномалий как в зрелых (сперматозоиды), так и в незрелых половых клетках (сперматоциты и сперматиды) у пациентов с полной формой синдрома Клайнфельтера [24].
При использовании гетерологичного оплодотворения ооцитов хомячка сперматозоидами пациента с кариотипом 47,XXY/46,XY (т.е. носителя мозаичного кариотипа) было выявлено увеличение частоты гипергаплоидии — 24,XY сперматозоидов до 0,9% [23]; данные о наличии 2% сперматозоидов с дисомией Х в эякуляте пациента с таким же мозаичным кариотипом были также получены ранее с помощью техники FISH [24]. Полученные нами результаты подтверждают предположение о том, что у пациентов с кариотипом 47,XXY может, по-видимому, происходить предпочтительная конъюгация гомологичных гоносом (в этих случаях хромосомы ХХ) и некоторые из таких гамет способны проходить через мейоз, формируя сперматозоиды [10, 23]. Однако у таких пациентов и в сперматидах и в сперматозоидах высока доля клеток с нерасхождением хромосом, что необходимо учитывать при проведении ИКСИ.
Наши данные прежде всего подтверждают необходимость проведения медико-генетического консультирования, в том числе цитогенетического исследования по лимфоцитам периферической крови пациентов с бесплодием неясного генеза. Установление нормального кариотипа свидетельствует лишь о том, что отсутствуют нарушения числа и структуры хромосом, выявляемые традиционным цитогенетическим методом. Однако это не исключает вероятности наличия микроструктурных перестроек хромосом или генных мутаций, выявление которых требует использования иных, чем традиционные цитогенетические исследования, а именно: молекулярно-цитогенетических методов исследования. Кроме того, как свидетельствуют наши данные, при отсутствии генных и хромосомных нарушений вероятны аномалии развития самих гамет, происходящие и в результате нарушения в них хромосом (вследствие существования определенной автономии гаметогенеза в организме). Это говорит о необходимости проведения в ряде случаев бесплодия анализа поведения хромосом на разных стадиях гаметогенеза. Разработка и использование в последние годы в этих целях молекулярно-цитогенетических методов исследования значительно повысили разрешающую ценность диагностических подходов.
Результаты молекулярно-цитогенетического анализа половых клеток у пациентов с нормальным и аномальным кариотипом и нарушением сперматогенеза подтверждают точку зрения на возможность выявления в гаметах, в первую очередь — в сперматозоидах и сперматидах, определенной доли хромосомных анеуплоидий. Последние могут явиться причиной нарушения сперматогенеза. Некоторые из таких сперматозоидов участвуют в оплодотворении и могут являться причиной формирования эмбриона с численным нарушением кариотипа. Практические успехи использования ИКСИ значительно опережают темпы разработки методов преимплантационной диагностики и углубления наших представлений о последствиях этих методов для здоровья рожденных таким образом детей и популяции в целом. Таким образом, нами установлена доля аномалии гоносом у лиц с нарушением сперматогенеза при нормальном и аномальном кариотипе, определены показания для проведения молекулярно-цитогенетической диагностики, подтверждена возможность применения молекулярно-цитогенетических методов для выявления анеуплоидии в интерфазно-подобных ядрах половых клеток. Решение проблемы определения риска передачи потомству хромосомных и генных мутаций при ИКСИ должно основываться на современных знаниях о хромосомных аномалиях в половых клетках на разных стадиях их развития.
Авторы выражают глубокую благодарность проф. Ю.Б. Юрову за предоставление хромосомоспецифичных ДНК-проб и проф. С.Г. Ворсановой за возможность выполнения данной работы и участие в обсуждении полученных результатов.
Литература
1. Kleczkowska A., Fryns J., van den Berghe H. X-chromosome polysomy in male: the Leuven experience 1966-1987. Hum Genet 1988; 80: 1:
16-22.
2. Ворсанова С.Г., Шаронин В.О., Курило Л.Ф. Аномалии половых хромосом при нарушении репродуктивной функции у мужчин. Пробл репрод 1998; 4: 2: 12-21.
3. Курило Л.Ф., Шаповал Н.В., Дубинская В.П. и др. Структура хромосомной патологии среди пациентов с нарушением репродуктивной системы. Тез. докл. 1 (3) Рос. съезда мед. генетиков. М 1994; 1:
85-86.
4. Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Мхитарова Е.В. и др. Структура наследственной патологии половой системы при обследовании пациентов с нарушением репродукции. Тез. докл. Рос. конф. . М 1997;
155-156.
5. Курило Л.Ф. Доля генетической патологии у пациентов с нарушением развития половой системы. Сб-к: Лекции для врачей. Сексопатология и андрология, вып. 4. Киев 1998; 18-27.
6. Rudak E., Jacobs P.A., Yanagimachi R. Direct analysis of the chromosome constitution of human spermatozoa. Nature 1978; 274:
911-913.
7. Martin R.H., Balkan W., Burns K. et al. The chromosome constitution of 1000 human spermatozoa. Hum Genet 1983; 63: 305-309.
9. Ворсанова С.Г., Казанцева Л.З., Юров Ю.Б. и др. Использование молекулярно-цитогенетических методов диагностики в генетической практике. Вопр охр мат и дет 1991; 11: 71-76.
9. Юров Ю.Б., Ворсанова С.Г., Бытенская Г.А. и др.
Молекулярно-интерфазная пост- и пренатальная диагностика синдромов, связанных с аномалиями половых хромосом. Сб-к научных трудов. М.
МОНИКИ, 1995; 1: 141-150.
10. Blanco J., Egozcue J., Vidal F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in situ hybridization. Hum Reprod 1996; 11: 722-726.
11. Miharu N., Best R.G., Young S.R. Numerical chromosome abnormalities in spermatozoa of fertile and infertile men detected by fluorescence in situ hybridization. Hum Genet 1994; 93: 502-506.
12. Wyrobek A.J., Robbins W.A., Mehraein Y. et al. Detection of sex chromosomal aneuploidies X-X, Y-Y, and X-Y in human sperm using two chromosome fluorescence in situ hybridization. Am J Med Genet 1994;
53: 1-7.
13. Yurov Y.B., Saias M.J., Vorsanova S.G. et. al. Rapid chromosomal analysis of germ-line cells by FISH: an investigation of infertile male with large-head spermatozoa. Molec Hum Reprod 1996; 2: 9:
665-668.
14. Guttenbach M., Schakowski R., Schmid M. Incidence of chromosome 3,7,10,11,17 and X disomy in mature human sperm nuclei as determinad by nonradioactive in situ hybridization. Hum Genet 1994; 93: 1:
7-12.
15. WHO Laboratory manual for the examination of human semen and spermcervical mucus interaction. Cambridge University press 1992.
16. Evans E.P., Breckon G., Ford C.E. An airdrying method for meiotic preparations from mammalian testes. Cytogenetics 1964; 3: 2:
289-294.
17. Templado C., Marina S., Coll M.D. et al. Meiotic Studies in Human Semen. Report of 180 Cases. Hum Genet 1980; 53: 335-339.
18. Курило Л.Ф., Любашевская И.А., Дубинская В.П. и др.
Количественный кариологический анализ состава незрелых половых клеток из эякулята. Урология и нефрология 1993; 5: 45-47.
19. Soloviev I.V., Yurov Y.B., Ioannou I. еt al. Identification and molecular-cytogenetic characterization og large subset of human plasmids, cosmids, PAC and YAC clones: the search of DNA probes for pre- and postnatal diagnosis. Cesko-Slovenska pediatrie 1997; 7:
529-538.
20. Yurov Y.B., Soloviev I.V., Vorsanova S.G. et al. DNA probes for pre- and postnatal diagnosis of chromosomal anomalies: a collection for FISH analysis. Cesko-Slovenska pediatrie 1997; 7: 550-554.
21. Guttenbach M., Engel V., Schmid M. Analysis of structural and numerical chromosome abnormalities in sperm of normal men and carriers of constitutional chromosome aberrations. A review. Hum Genet 1997; 100: 1: 1-21.
22. Speed R.M., Chandley A.C. Prophase of meiosis in human spermatocytes analysed by EM microspreading in infertile men and their controles and comparisons with human oocytes. Hum Genet 1990;
84: 547-554.
23. Cozzi J., Chevret E., Rousseaux S. et al. Achievment of meiosis in XXY germ cells: study of 543 sperm karyotypes from an XY/XXY mosaic patient. Hum Genet 1992; 93: 32-34.
24. Курило Л.Ф., Шаронин В.О., Ворсанова С.Г. Уровень нерасхождения хромосом на разных стадиях развития мужских половых клеток человека. Пробл репрод 1998; 4: 6.
Copyright © 2000-2005, РОО «Мир Науки и Культуры». ISSN 1684-9876