Эндометриоз и илмфоциты

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови и перитонеальной жидкости у женщин с эндометриозом Д.В. Куявская, К.В. Григорян, С.Ф. Торубаров, Г.Т. Сухих Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, Москва Проблемы репродукции, 2-1999, с.62-64 В начало...

Изучение субпопуляционного состава мононуклеарных клеток периферической крови и перитонеальной жидкости при разных стадиях эндометриоза (метод проточной цитофлуориметрии) выявило значительные изменения в составе лимфоцитов, более выраженные в перитонеальной жидкости пациенток. Описанные нарушения в иммунитете могут играть немаловажную роль в возникновении и развитии заболевания.

Ключевые слова:

эндометриоз, лимфоциты, перитонеальная жидкость, цитофлюориметрия.

Словарь сокращений

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ФЭ - фикоэритрин

ГКГС - главный комплекс гистосовместимости ЕК-клетки - естественные киллерные клетки ТКР - рецептор Т-клеток Наружный генитальный эндометриоз является важной проблемой современной гинекологии, так как, несмотря на совершенствование в течение последнего десятилетия методов диагностики и лечения, заболевание остается одной из самых частых патологий у женщин репродуктивного возраста: заболевание поражает 15-20% женщин в возрасте 20-35 лет [4]. Вопрос об этиологии и патогенезе эндометриоза, несмотря на большое число концепций, в которых делается попытка дать объяснение причинам и механизмам данного заболевания, остается открытым. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о существенной роли в патогенезе эндометриоза нарушений иммунного гомеостаза. У пациенток с эндометриозом выявляются значительные изменения как на системном (увеличение содержания Т-, ЕК-лимфоцитов в периферической крови), так и на локальном (возрастание количества лимфоцитов, нарушение функциональной активности естественных киллерных клеток (ЕК-клеток) в перитонеальной жидкости) уровнях [8, 14]. При этом большинство авторов рассматривают смешанную группу больных эндометриозом, куда входят пациентки со всеми стадиями заболевания. В настоящем исследовании мы изучали содержание лимфоидных клеток и их фенотипы в периферической крови (ПК) и перитонеальной жидкости (ПЖ) женщин с эндометриозом в зависимости от степени распространенности заболевания.

Материал и методы

В настоящее исследование вошло 40 пациенток, проходивших обследование и лечение в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН по поводу наружного генитального эндометриоза, и 17 соматически здоровых женщин с нормальной репродуктивной функцией, поступивших в центр для проведения хирургической стерилизации (группа контроля).

Пациентки с наружным генитальным эндометриозом были разделены на две группы, сформированные на основе диагноза. В 1-ю группу вошли женщины с I-II степенью распространенности эндометриоза (по классификации Американского общества фертильности), во 2-ю группу - с III-IV степенью распространенности. Материалом для исследования служили клетки ПК и ПЖ пациенток с эндометриозом и женщин контрольной группы. ПК получали из локтевой вены обследуемых лиц в асептических условиях в пробирки, содержавшие 0,5 мл раствора гепарина в среде 199 (25 ЕД гепарина на 1 мл крови). Выделение мононуклеарных клеток (МНК) проводили центрифугированием на градиенте плотности фиколла (Lymphocyte Separation Medium, Flow Laboratories, США, r=1,077 г/см2).

ПЖ собирали во время проведения оперативной лапароскопии по поводу эндометриоза либо стерилизации по Zemm. ПЖ собирали из дугласова и переднематочного пространства непосредственно после вхождения в полость малого таза, до начала лапароскопических манипуляций для предотвращения попадания в ПЖ крови. Геморрагические образцы перитонеальной жидкости не исследовали. ПЖ собирали в стерильные гепаринизированные пробирки (Falcon, США) при комнатной температуре и максимально быстро доставляли в лабораторию [15]. Мононуклеарные клетки (МНК) ПЖ выделяли аналогично выделению МНК крови. Выделенные МНК ПК и ПЖ окрашивали для последующего анализа на проточном цитофлуориметре, используя моноклональные антитела:

Anti-Leu-4 (CD3), Anti-Leu-3a (CD4), Anti-Leu-2a (CD8), Anti-Leu-11b (CD16), Anti-Leu-12 (CD19), Anti-TCRgd (, США). Для контроля неспецифического связывания моноклональных антител использовали соответствующие контроли изотипов иммуноглобулинов (, США), меченные ФИТЦ и ФЭ.

Фенотипирование лимфоцитов ПК и клеток ПЖ проводили на проточном цитофлюориметре (Bio-Rad, Италия). Из каждой пробы анализировали 5000 жизнеспособных клеток, дискриминируемых по интенсивности свечения пропидиума йодида.

Cтатистическая обработка экспериментальных данных проводилась с помощью компьютерной программы , достоверность межгрупповых различий определялась по t-критерию Стьюдента. Данные представлены в виде среднего ошибка среднего (М m).

Результаты

В ПК женщин с III-IV степенью эндометриоза обнаружено достоверное снижение общего количества Т-лимфоцитов, а также выраженное повышение процентного содержания В- и ЕК-клеток (р<0,01). По этим показателям были зафиксированы также межгрупповые различия. Изменения в клеточном звене иммунитета у женщин с малыми формами эндометриоза выражались в снижении содержания клеток CD8+ фенотипа и увеличении относительного количества -Т-клеток (табл. 1).

Таблица 1. Относительное содержание (в % ) основных клеточных популяций в ПК женщин с эндометриозом разной степени и контрольной группы (M m)

Кластер дифференцировки (CD)Контрольная группа (n=17)Больные эндометриозом I-II степени (n=20)III-IV степени (n=20)

CD364,2 1,5962,0 1,456,8 2,2a

CD438,7 1,337,5 1,734,9 1,8

CD825,6 1,320,7 1,7a24,5 2,0

CD4/CD81,6 0,12,1 0,2a1,7 0,2 -Т-клетки4,1 0,957,2 0,73b6,7 1,6 CD197,2 0,86,8 1,010,5 0,8bc CD1616,5 1,418,7 1,325,7 1,5bc Примечание. Здесь и в табл. 2: a - статистически значимые различия по t-критерию Стьюдента в сравнении с соответствующим контролем: p<0,05; b - p<0,01; c - статистически значимые различия между группами эндометриоза, p<0,05.

Известно, что величина <индекса иммунорегуляции> (CD4/CD8) является важным показателем гармоничной функции иммунной системы. Как следует из представленных данных, у больных эндометриозом I-II стадии отмечается тенденция к увеличению этого показателя, по-видимому, за счет снижения содержания клеток CD8+. При сравнении содержания лимфоцитов в ПЖ пациенток с эндометриозом и здоровых женщин не выявлено различий в относительном количестве В-клеток (CD19+) и ЕК-лимфоцитов (CD16+), тогда как во 2-й группе в Т-клеточном звене было обнаружено значительное увеличение как общего количества Т-лимфоцитов, оцениваемого по содержанию клеток CD3+, так и повышение содержания клеток регуляторных субпопуляций - хелперов/индукторов (CD4+) и супрессоров/цитотоксических (CD8+) (табл. 2). Данные различия оказались статистически достоверными при сравнении с результатами анализа не только в контроле, но и в 1-й группе. В 1-й группе исследования не отмечено изменения содержания Т-лимфоцитов, за исключением клеток, экспрессирующих -Т-клетки.

Таблица 2. Относительное содержание (в %) основных клеточных популяций в ПЖ женщин с эндометриозом разной степени и контрольной группы Кластер дифференцировки (CD)Контрольная группа (n=17)Больные эндометриозом I-II степени (n=20)III-IV степени (n=20)

CD349,5 4,158,3 2,267,4 3,6b

CD421,8 1,922,1 1,629,1 2,1aс

CD832,6 1,731,1 2,139,8 3,1aс

CD4/CD80,7 0,061,1 0,20,9 0,12

-Т-клетки7,1 1,217,3 3,4aс10,6 2,1

CD191,2 0,40,9 0,42,2 0,3

CD168,3 2,218,1 8,98,2 2,1

Обсуждение результатов

Исследованию популяций лимфоцитов ПК при эндометриозе было посвящено много работ, так как известно, что патологические изменения в органах и тканях, содержащих большое количество иммунокомпетентных клеток, могут вызывать значительные изменения в клеточном составе ПК [17], и путем оценки субпопуляционного состава лимфоцитов ПК можно получить информацию о состоянии иммунной системы в целом. При фенотипировании лимфоцитов ПК пациенток с разной степенью эндометриоза выявлены следующие нарушения иммунитета в группах: при малых формах содержание супрессорно-цитотоксической субпопуляции Т-клеток (CD8+) изменялось в сторону снижения, вследствие чего имеет место увеличение иммунорегуляторного индекса CD4/CD8, кроме того, отмечалось увеличение процента -Т-клеток. При III-IV степени эндометриоза были обнаружены другие изменения - повышение содержания В-клеток и ЕК-лимфоцитов. Увеличение содержания ЕК-клеток, ответственных за уничтожение попавших в перитонеальную полость путем ретроградного заброса менструальной крови [9], может быть немаловажным фактором при данном заболевании. Учитывая, что при эндометриозе, с одной стороны, происходит увеличение содержания ЕК-клеток, а, с другой - снижение ЕК-активности [10, 14], можно предположить функциональный дефект этого звена иммунитета. Уменьшение относительного количества клеток фенотипа CD3+, зафиксированное в группе женщин с III-IV степенью эндометриоза, по-видимому, происходит вследствие снижения содержания обеих (CD4+ и CD8+) иммунорегуляторных субпопуляций, поэтому иммунорегуляторный индекс не изменялся. Таким образом, результаты фенотипирования лимфоцитов ПК подтвердили ранее выявленные нарушения клеточного звена иммунитета у больных эндометриозом [2, 5, 15], которые различны по проявлениям у женщин с разной степенью заболевания. Как и предполагалось, значительно более выраженные изменения в функционировании иммунной системы обнаруживаются на уровне локальном, в непосредственной близости от имплантатов - в ПЖ. Последняя, представляющая микроокружение очагов эндометриоза, содержит как множество растворимых факторов, влияющих на процесс имплантации и роста эндометриоидных эктопий, так и большое количество клеточных элементов, эти факторы продуцирующих [10, 13]. Существует много работ, указывающих на нарушения в клеточном иммунитете при эндометриозе.

Нами показано, что В-клетки представлены в ПЖ как больных эндометриозом, так и здоровых женщин в очень незначительном (1-2%) количестве. Выявленные изменения иммунитета на локальном уровне касались в основном Т-клеточного звена и проявились увеличением общего количества Т-лимфоцитов, содержания клеток хелперной субпопуляции (CD4+) и относительного содержания -Т-лимфоцитов. Иммунорегуляторный индекс также возрастал. Эти результаты подтверждают наличие воспалительного процесса в перитонеальной полости [3, 7]. Увеличение при эндометриозе содержания Т-лимфоцитов, в активированном состоянии вырабатывающих спектр цитокинов и факторов роста, в свою очередь способных усиливать рост эндометриоидных клеток in vitro [11], предполагает нарушения в регуляции иммунного ответа. В последние годы выявлены многочисленные биохимические различия эндометриоидной ткани с эутопическим эндометрием, вследствие чего эктопический эндометрий может быть процессирован антиген-презентирующими клетками и представлен Т-лимфоцитам [16]. <Антигенность> собственного эндометрия, имплантировавшегося в перитонеальной полости и вызвавшего заболевание, подтверждает также увеличение содержания на начальных этапах заболевания -Т-лимфоцитов, клеток, которые, как известно, независимы от главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) и способны быстро распознавать антиген и реагировать на него [12]. В то же время повышенное количество -Т-лимфоцитов определяется у больныхаутоиммунными заболеваниями, например, с синдромом Сьогрена [6], что также косвенно подтверждает возможность аутоиммунных нарушений, которые описывают многие исследователи, у больных эндометриозом. По-видимому, вслед за активацией иммунных процессов на начальных стадиях заболевания на более поздних воспалительный процесс, развивающийся в ответ на присутствие эндометриоидной ткани в перитонеальной полости и из-за невозможности удаления очагов эндометриоза, прогрессирует, в результате чего возникают инфильтрация, фиброз и инкапсуляция очагов эндометриоза [1]. Это подтверждается результатами нашего исследования, в ходе которого были выявлены изменения в Т-клеточном звене иммунитета при III-IV степени эндометриоза.

Все вышеуказанные нарушения в иммунной системе, по-видимому, являются важным звеном в патогенезе эндометриоза. Понимание иммунных процессов, происходящих при эндометриозе как на локальном, так и на системном уровнях, несомненно, позволит найти новые методы диагностики и лечения этого заболевания.

Литература

1. Баскаков В.П. Клиника и лечение эндометриоза. Л Медицина 1990;

240.

2. Старцева Н.В. Клинико-иммунологические аспекты генитального эндометриоза. Акуш и гинек 1980; 3: 23.

3. Badaway S., Cuenca V., Freliech H. Endometrial antibodies in serum and peritoneal fluid of infertile patients with and without endometriosis. Fertil Steril 1990; 53: 930-932.

4. Barbieri R.L. Etiology and epidemiology of endometriosis. Amer J Obstet Gynecol 1990; 162: 2: 565-567.

5. Dmowski W.P. Immunological aspects of endometriosis. Int J Gynaecol Obstet 1995; 50: Suppl 1: 3-10.

6. Gerli R., Agea E., Muscat C. et al. Functional characterization of bearing the gamma-delta T-cell receptor in patients with primary Sjogren’s syndrome. Clin Exp Rheumatol 1993; 11(3): 326.

7. Halme J., Becker S., Haskill S. Altered maturation and function of peritoneal macrophages: possible role in pathogenesis of endometriosis. Am J Reprod Immunol 1987; 156: 783- 788.

8. Haney A., Muscat J., Weinberg J. Peritoneal fluid cell populations in infertility patients. Fertil Steril 1981; 35:

696-699.

9. Hill J.A., Heidi M.P., Schiff I., Anderson D.J. Characterization of leucocyte subpopulations in the peritoneal fluid of women with endometriosis. Fertil Steril 1988; 50(2): 216-223.

10. Ho H.-H., Chao K.-H., Chen H.-F. et al. Peritoneal natural killer cytotoxicity and CD25+CD3+ lymphocyte subpopulation are decreased in women with stage III-IV endometriosis. Hum Reprod 1995;

10: 10: 2671-2675.

11. Hornung D., Ryan I.P., Chao V.A. et al. Immunolocalization and regulation of the chemokine RANTES in human endometrial end endometriosis tissues and cells. J Clin Endocrinol Metab 1997;

82(5): 1621-1628.

12. Kaufmann S.H. gd and other inconventional T lymphocytes: What do they see and what do they do? Proc Nat Acad Sci USA 1996; 93:

2272-2279.

13. Kubicka U., Olszewski W.L., Tarnowski W., Bielecki K., Ziolkowska A., Wierbicki Z. Normal Human Immune Peritoneal Cells:

Subpopulations and Functional Characteristics. Scand J Imminol 1996;

44: 157-163.

14. Oosterlynk D.J., Meuleman C. et al. The natural killer activity of peritoneal fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis. Fertil Steril 1992; 58: 2: 290.

15. Oosterlynk D.J., Meuleman C., Lacquet F.A. Flow Cytometry analysis of lymphocyte subpopulation in peritoneal fluid of women with endometriosis. Am J Reprod Immunol 1994; 31(1): 25-31.

16. Ota H., Igarashi S. Expression of major histocompatibility complex class II antigen in endometriotic tissue in patients with endometriosis and adenomiosis. Fertil Steril 1993; 60(5): 834-838.

17. Westermann J., Pabst R. Lymphocyte subsets in the peripheral blood: diagnostic window on the lymphoid system? Immunology Today 1990; 11: 11: 406-409.

Copyright © 2000-2005, РОО «Мир Науки и Культуры». ISSN 1684-9876