На правах рукописи
ДЮЖЕВА ЕЛЕНА ВАЛЕРЬЕВНА
ГОРМОНАЛЬНАЯ ПОДГОТОВКА ЭНДОМЕТРИЯ У ПАЦИЕНТОК С НЕЭФФЕКТИВНЫМИ ПОПЫТКАМИ ЭКО В АНАМНЕЗЕ…..
14.01.01 – акушерство и гинекология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2010
Работа выполнена в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия и лаборатории патоморфологии Федерального Государственного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова Росмедтехнологий».
Научные руководители:
доктор медицинских наук Елена Анатольевна Калинина
доктор медицинских наук, профессор Евгения Алтаровна Коган
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор Татьяна Алексеевна Назаренко
(ФГУ «НЦ АГиП им.В.И. Кулакова)
профессор, доктор медицинских наук Мишнев Олеко Дмитриевич
(РГМУ)
Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский Университет дружбы народов
Защита диссертации состоится «27» апреля 2010 г. в 13 ч. на заседании диссертационного совета Д.208.125.01 при ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» по адресу: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова».
Автореферат разослан «____» __________2010г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук Елена Анатольевна Калинина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Одним из наиболее современных и перспективных методов лечения бесплодия является экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов (ЭКО и ПЭ). Улучшение результативности ЭКО во многом связано не только с особенностями фолликулярного аппарата яичников, качеством эмбриона, но и с маточными структурами, в частности — с функциональным состоянием эндометрия, его зрелостью и готовностью к имплантации.
Пациентки с многократными неудачными программами вспомогательных репродуктивных технологий составляют около 30% от всех пациентов, которые лечатся с использованием этих методов (И.А. Судома, Ю.В. Маслий, 2007). Неадекватная рецептивность эндометрия ответственна приблизительно за две трети неудач имплантации, тогда как эмбрион — только за одну треть (N. Ledee-Bataille, 2002).
Так как большинство исследований отрицают роль гистологического датирования эндометрия (определения соответствия морфологической структуры оболочки матки дню менструального цикла) в клинике бесплодия (C. Coutifaris, 2004; E.R. Myers, 2004), в настоящее время развиваются альтернативные методы оценки функции эндометрия, а также ведется активный поиск биологических маркеров «окна имплантации», способных прогнозировать наступление беременности в программах ВРТ.
Многочисленные исследования посвящены изучению потенциальных маркеров восприимчивости эндометрия как предикторов наступления беременности и, при этом, в основном помогли определить клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых происходят этапы имплантации (H. Achache, 2006; K. Diedrich, 2007). Однако использование даже наиболее изученных в настоящее время биомаркеров имплантации в клинической практике крайне ограничено (B. Urman, 2005).
Одними из наиболее изученных биомаркеров «окна имплантации» являются пиноподии – структуры, появляющиеся в апикальной части поверхностного эпителия эндометрия в период максимальной рецептивности (C.E. Quin, 2009).
Большинство идентифицированных маркеров имплантации (пиноподии, интегрин αvβ3, LIF, Е-катгерин, HOX гены и др.) регулируются путем прямого или опосредованного влияния эстрадиола и прогестерона (P.H. Kodaman, 2004; H. Achache, 2006).
Однако важен не только уровень половых стероидов в организме, но и сохранение всех путей реализации гормонального эффекта, в чем решающую роль играет количество функционально полноценных рецепторов ткани эндометрия к соответствующим стероидным гормонам (А.В. Светлаков, 2002).
В течение нормального менструального цикла содержание в эндометрии рецепторов к эстрогенам и прогестерону претерпевает закономерные колебания, синхронные с изменением концентрации эстрадиола и прогестерона в общем и маточном кровотоке (O.H. Лысенко, 2004; A.H. Taylor, 2005).
Некоторые авторы (С.В. Никитин, 2006; A.П. Лазарев, 2007) полагают, что у пациенток, страдающих трубно-перитонеальным бесплодием, существует гормональная недостаточность яичников, связанная с низкими количеством и/или чувствительностью рецепторов эстрогенов и прогестерона в эндометрии, и указанные изменения рецептивности эндометрия у женщин с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе могут явиться причиной неудач последующих циклов ВРТ. Другие авторы приводят диаметрально противоположные данные (В.С. Бессмертная, 2008), говоря о повышение экспрессии стероидных рецепторов у пациенток с бесплодием.
В настоящее время в научной литературе продолжается дальнейшая дискуссия и изучение рецепторного аппарата эндометрия у пациенток с повторными неудачами имплантации в программах ВРТ.
Также нет единого мнения о схемах гормональной подготовки к программе ЭКО и ПЭ, длительности их применения и влиянии различной гормональной терапии на функциональное состояние эндометрия и готовности его к имплантации. Не разработаны прогностические критерии наступления беременности у пациенток с неудачными попытками в рамках циклов ВРТ.
Результаты различных исследований достаточно противоречивы, поэтому представляется актуальным определение целесообразности и эффективности применения гормональной терапии для подготовки к программе ЭКО у пациенток с ранее неэффективными попытками на основании морфофункционального состояния эндометрия.
Цель исследования: повышение результативности лечения бесплодия методом ЭКО и ПЭ путем оптимизации тактики предварительной подготовки эндометрия у пациенток с неэффективными попытками в анамнезе.
Задачи исследования
1. Изучить параметры клинико-гормонального статуса, фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе.
2. Провести анализ морфологической структуры, особенностей поверхностного эпителия и состояния рецепторного аппарата эндометрия у пациенток с отрицательным результатом ЭКО по сравнению с теми, у которых впоследствии наступила беременность.
3. Выявить факторы, определяющие неудачи имплантации и разработать прогностические критерии наступления беременности на основании морфологического и иммуногистохимического исследования эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО и ПЭ.
4. Определить группы пациенток, которым целесообразно применение гормональной подготовки эндометрия.
5. Оценить динамику морфологических изменений и структурных особенностей эндометрия в ответ на применение циклической гормональной терапии и провести анализ частоты наступления беременности.
6. Разработать алгоритм предварительной подготовки эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе на основании морфологических и иммуногистохимических особенностей эндометрия.
Научная новизна
В результате проведенных исследований получены новые данные о состоянии рецепторного аппарата эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе, проведена детальная оценка состояния поверхностного эпителия эндометрия.
На основании комплексной оценки морфологического и иммуногистохимического анализа эндометрия выявлены и углубленно изучены варианты нарушений экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов у пациенток с повторными неудачами имплантации в программах ВРТ: снижение уровня ПР и ЭРα в сочетании с соотношением ПР/ЭРα≥2 или ПР/ЭРα<2, гиперэкспрессия ЭРα в секреторную фазу МЦ в сочетании с соотношением ПР=ЭРα или ПР/ЭРα<2.
Впервые проведена оценка количества поверхностных клеток эпителия с наличием пиноподий при гистологическом исследовании эндометрия, показана и научно подтверждена их прогностическая значимость для наступления беременности в программе ЭКО.
Патогенетически обоснована целесообразность и эффективность применения циклической гормональной терапии с использованием трансдермальных эстрогенов и микронизированного прогестерона в качестве подготовки эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО при сниженной экспрессии прогестероновых и α-эстрогеновых рецепторов, не соответствующей морфологическим характеристикам эндометрия.
Практическая значимость
В результате проведенной работы определены наиболее важные прогностические критерии наступления беременности в рамках программ ВРТ у пациенток с ранее неэффективными попытками.
Без применения электронной микроскопии в гистологических препаратах проведена количественная оценка клеток поверхностного эпителия, имеющих пиноподии. Трехкратное снижение процентного содержания пиноподий, отмеченное в образцах эндометрия у пациенток с повторными безуспешными попытками ЭКО, подтверждает их роль в прогнозировании наступления беременности. Продемонстрирована возможность определения пиноподий при световой микроскопии, что позволяет рекомендовать их изучение в гистологических препаратах при подготовке к беременности у женщин с бесплодием.
Обосновано включение в схему предварительного обследования пациенток с повторными неудачами имплантации иммуногистохимического исследования эндометрия, позволяющего выявить нарушения экспрессии стероидных рецепторов эндометрия, что позволяет дифференцированно подходить к назначению соответствующего гормонального лечения с целью повышения эффективности экстракорпорального оплодотворения.
Разработан алгоритм предварительной гормональной подготовки эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе.
Положения, выносимые на защиту
1. При сходных параметрах фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза у пациенток с неэффективными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе выявляются нарушения экспрессии прогестероновых и эстрогеновых рецепторов в эндометрии (снижение уровня ПР и ЭРα в сочетании с соотношением ПР/ЭРα≥2 или ПР/ЭРα<2, гиперэкспрессия ЭРα в секреторную фазу МЦ в сочетании с соотношением ПР=ЭРα или ПР/ЭРα<2)
2. Наиболее неблагоприятным прогностическим признаком для наступления беременности у пациенток в программе ЭКО при неудачах имплантации является гиперэкспрессия эстрогеновых рецепторов α в период предполагаемого «окна имплантации», а наиболее благоприятным - сочетание равномерных секреторных преобразований эндометрия с количеством пиноподий ≥50% и соотношением ПР/ЭРα≥2.
3. Комплексное морфологическое и иммуногистохимическое исследование эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ВРТ в анамнезе позволяет дифференцированно подходить к целесообразному и эффективному назначению циклической гормональной терапии для подготовки к ЭКО, что позволяет повысить результативность данной программы.
Апробация материалов диссертации
Основные положения диссертации и результаты работы доложены на X Юбилейном всероссийском форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2009) и 3rd Asia Pacific Congress on Controversies in Obstetrics Gynecology and Infertility (Пекин, 2009). Работа обсуждена на межклинической конференции сотрудников отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» 03.12.2009 и заседании апробационной комиссии ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» 21.12.2009.
Внедрение результатов исследования в практику
Комплексное обследование эндометрия, включающее морфологический и иммуногистохимический методы исследования у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе и применение гормональной подготовки эндометрия внедрено в практику работы отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГУ НЦ АГиП им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий.
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 135 страницах компьютерного текста, состоит из введения и 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение), а также выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 15 рисунками. Использованная литература включает 31 источник на русском и 142 источника на английском языках.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы
В соответствии с поставленной целью и задачами исследования в ходе выполнения работы обследованы 108 пациенток репродуктивного возраста с трубно - перитонеальным фактором бесплодия и 2-мя и более неэффективными попытками ЭКО в анамнезе, обратившихся по поводу бесплодия в отделение вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГУ «НЦ АГ и П им. академика В.И. Кулакова» Росмедтехнологий (руководитель - профессор Кузьмичёв Л.Н.). В дальнейшем 11 пациенток были исключены из исследования, так как по результатам гистологии у них была выявлена патология эндометрия (хронический эндометрит или гиперплазия эндометрия).
Предварительное обследование супружеской пары проводилось с использованием общеклинических и специальных методов исследования.
На первом этапе работы аспирационная пайпель-биопсия эндометрия выполнена у 62 пациенток в цикле, предшествующем стимуляции суперовуляции, на 7-8 день после овуляции, которую устанавливали при динамическом ультразвуковом контроле в течение изучаемого цикла и определении пика ЛГ с помощью мочевого теста. Далее сформированы 2 группы сравнения в зависимости от эффективности реализации в дальнейшем программы ЭКО: I группа (n=15) - пациентки, у которых наступила беременность, II группа (n=47) - пациентки с отрицательным результатом.
На втором этапе работы, в соответствии с результатами гистологического и иммуногистохимическго (ИГХ) исследования эндометрия была сформирована III группа (n=35), которую составили больные, получившие гормональную терапию в качестве подготовки к следующей программе ЭКО и ПЭ. У пациенток III группы также проводилась контрольная биопсия на фоне приема гормональных препаратов на 21-24 день МЦ (рис. 1).
Группой контроля явились 15 фертильных женщин без гинекологической патологии, у которых исследовали структуру эндометрия.
Рисунок 1. Схема выполнения исследования и разделения пациенток на группы
Стимуляция суперовуляции у всех пациенток проводилась по короткому протоколу со 2-3 дня МЦ с использованием препаратов рФСГ и антагонистов ГнРГ.
Циклическая гормональная подготовка проводилась с использованием трансдермального эстрадиола и микронизированного прогестерона.
Гистологическое и ИГХ исследование эндометрия проводили в лаборатории патоморфологии ФГУ «НЦ АГ и П им. академика В.И.Кулакова» Росмедтехнологий (руководитель проф. Е. А. Коган).
Материалы биоптатов фиксировали в 10%-м нейтральном формалине, заключали в парафин, делали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. При исследовании гистологических препаратов также проводилась оценка % клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в световом микроскопе при увеличении х400.
Для ИГХ реакций парафиновые срезы обрабатывали по стандартной методике, использовали мышиные моноклональные антитела к эстрогеновым рецепторам α (клон 1D5 «DAKO») и прогестероновым рецепторам (клон 636 «DAKO»).
Для анализа результатов ИГХ реакций использовали метод гистологического счета H-score по формуле: HS = 1a+2b+3c, где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно окрашенных клеток, с - % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 – интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Степень выраженности экспрессии ЭР и ПР расценивали: 0-10 баллов – отсутствие экспрессии, 11-100 баллов – слабая экспрессия, 101-200 баллов – умеренная экспрессия, 201-300 баллов – выраженная экспрессия.
Статистическая обработка данных выполнена с помощью пакета прикладных программ «Statistica for Windows» v. 7.0, StatSoft Inc..
Сравнение между группами проводили непараметрическими методами с использованием критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считались отличия при P<0,05 (95%-й уровень значимости) и при P<0,01 (99%-й уровень значимости). Для исследования влияния одной или нескольких независимых переменных на одну зависимую переменную использовался одномерный дискриминантный анализ - метод бинарной логистической регрессии. Относительный шанс (ОШ) наступления беременности вычисляли по методу Woolf.
Результаты исследования и их обсуждение
Возраст обследованных пациенток не различался между исследуемыми группами и колебался от 22 до 35 лет, составляя в среднем 32,2 ± 0,3 года.
Средняя продолжительность бесплодия колебалась от 2 до 14 лет и составила в среднем 6,3 ± 0,4 лет.
Среднее количество неудачных циклов ЭКО не различалось между исследуемыми группами и составило 2,7±0,3 в I группе, 2,7±0,2 - во II группе, 2,6±0,2 - в III группе. Более половины женщин (65%) имели 2 попытки ЭКО в анамнезе, каждая третья пациентка (35%) - 3 и более неудачных циклов лечения. Существенных и достоверных различий между группами не выявлено.
Изучая параметры стимуляции суперовуляции у обследованных пациенток, не выявлено статистически значимых различий между группами пациенток в отношении течения стимуяции суперовуляции, параметров фолликулогенеза, оогенезе и раннего эмбриогенеза (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика параметров стимуляции суперовуляции, фолликулогенеза, оогенеза и эмбриогенеза у пациенток исследуемых групп
Параметры I группа II группа III группа
Стартовая доза рФСГ, МЕ 189,3±14,8 201,6±11,1 181,7±9,6
Длительность стимуляции, дни 10,7±1,6 10,6±0,2 9,3±0,2
Общая доза рФСГ, МЕ 1942,9±133,2 1922,4±78 1830,8±54,1
Среднее количество фолликулов диаметром ≥ 18 мм 12±0,8 11,6±0,7 11,7±0,7
Среднее количество полученных ооцитов 8,9±1,3
8,3±0,6 7,9±0,6
Количество зрелых ооцитов 7,2±0,9 6,4±0,5 6,6±0,7
Доля зрелых ооцитов, % 80,9 77,1 83,5
Количество оплодотворенных ооцитов 6,8±0,9 5,7±0,6 6,1±0,7
Общее количество эмбрионов 4,4 ±0,6 3,8±0,4 4,1±0,4
Количество перенесенных эмбрионов 1,9±0,1 1,8±0,2 1,9±0,1
р > 0,05 статистически значимых различий не выявлено
В связи с этим, представлялось наиболее важным уделить особое внимание структуре эндометрия у данных пациенток.
В контрольной группе во всех биоптатах наблюдался эндометрий фазы секреции. Среднее значение уровня ПР составил в клетках поверхностного эпителия и желез 132,5±9,5, в строме — 208,8±11,6 баллов. Показатели ЭРα в среднем составили в клетках поверхностного эпителия и желез 63,2±6,7, в строме – 89,8±4,1 баллов. Во всех биоптатах в группе контроля соотношение ПР/РЭα было более 2 (среднее значение в поверхностном эпителии – 2,1±0,3, в железах — 2,1±0,3, в строме – 2,3±0,2).
У 93,3% пациенток, беременных после ЭКО (I группа) морфологическая картина эндометрия соответствовала фазе секреции. Как известно, основным методом исследования пиноподий является сканирующая электронная микроскопия. Однако, размер пиноподий у человека составляет в среднем 6 μm (C.E. Quinn, 2009), в связи с чем в данном исследовании показалось возможным оценить процент поверхностных клеток эпителия с наличием апикального выпячивания (предположительно пиноподии) при рутинном гистологическом исследовании с использованием световой микроскопии (рис. 2).
Рисунок 2. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400, 80% клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий
В I группе у всех пациенток количество клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий было ≥50% (среднее значение составило 66,7±2,95).
Во всех исследованных образцах отмечалось ядерное ИГХ окрашивание ПР. В поверхностном эпителии и в железах уровень ПР составил в среднем 206,7±20,2 и 230±18,2 баллов соответственно, в строме — 242,3±11,8. Количество ЭРα в ядрах клеток поверхностного эпителия составило в среднем — 98,3±15,6, железах 102,1±15,2, строме 100,3±15,6 баллов. Интересен тот факт, что помимо ядерной ИГХ реакции на ЭРα, также наблюдалось апикальное цитоплазматическое окрашивание, которое локализовалось исключительно в клетках поверхностного эпителия, где были сформированы пиноподии (рис. 3).
Возможно, данное наблюдение связано с наличием мембранных ЭРα в клетках эндометрия. Механизм действия и структурные особенности мембранных эстрогеновых рецепторов (мЭР) в настоящее время точно не определены, однако предполагают, что мЭР отвечают за быструю передачу эстроген-индуцированных сигналов в клетке (E.R. Levin, 2009).
а б
в г
а — Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400, 80% клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий.
б — ИГХ к ПР. H-score поверхностный эпителий – 210, железы – 210, строма – 220
в — ИГХ к ЭРα. H-score: поверхностный эпителий – 100, железы – 100, строма – 60
г — ИГХ к ЭРα. Апикальное цитоплазматическое окрашивание в проекции пиноподий
Рисунок 3. Нормальная экспрессия ЭРα в фазу секреции (ПР/ЭРα>2).
Соотношение ПР/ЭРα у 86,7% пациенток с морфологической картиной секреторной фазы было более 2 (среднее значение: поверхностный эпителий – 2,6±0,3, железы – 2,8±0,3, строма – 3,2±0,2).
Таким образом, в группе беременных после ЭКО, наблюдалась умеренная или выраженная экспрессия ПР и слабая или умеренная экспрессия ЭРα в поверхностном эпителии и строме, подобная результатам, полученным в группе контроля. Статистически значимое различие (р<0,05) в уровне ПР и ЭРα отмечалось только в клетках желез. Существенным представляется тот факт, что показатели стероидной рецепции в строме у пациенток, беременных после ЭКО, не отличались от группы контроля, поскольку современные представления предполагают, что именно строма играет решающую роль в успешной имплантации эмбриона и последующем развитии беременности (M.T. Mazur, 2005).
При гистологическом исследовании эндометрия у 29,8% пациенток II группы (небеременные после ЭКО) обнаружена поздняя стадия фазы пролиферации (IIА подгруппа), у 57,5% - фаза секреции (IIБ подгруппа), у 12,8% - неполноценная фаза секреции с асинхронным развитием желез в стадии поздней пролиферации и начала ранней секреции (IIВ подгруппа).
Так как в течение менструального цикла происходят физиологические колебания экспрессии ПР и ЭРα, невозможно оценивать их показатели без учета морфологической характеристики эндометрия и детального изучения уровней ПР и ЭРα в зависимости от гистологического датирования эндометрия.
Среди пациенток II группы, у которых обнаружена фаза пролиферации (IIА подгруппа) соотношение ПР/ЭРα<2, обнаружено у 50% пациенток, в остальных биопсиях наблюдалось соотношение ПР/ЭРα≥2. Во IIА подгруппе обнаружено статистически значимое уменьшение уровня ПР в строме эндометрия (р<0,05) и тенденция к более низкой экспрессии ПР в клетках поверхностного эпителия и желез, чем в группе контроля. Достоверных различий в количестве ЭРα не было выявлено (р>0,05). Однако, по данным литературы поздняя стадия фазы пролиферации в нормальном эндометрии характеризуется максимально высокой экспрессией и ПР и ЭРα во всех клетках эндометрия (О.Н. Лысенко, 2004). Таким образом, у данной подгруппы пациенток наблюдалось снижение стероидной рецепции эндометрия, вызванное недостаточной эстрогеновой стимуляцией рецепторного аппарата в I фазу менструального цикла, так как у них отмечен достоверно более низкий уровень Е2 на 3-5 день МЦ, чем в группе беременных после ЭКО пациенток (187,9±16,9 пмоль/л и 263,7±18,5 пмоль/л, соответственно; р<0,05).
Среди пациенток IIБ подгруппы (с фазой секреции) только у 25% наблюдалось соотношение ПР/ЭРα≥2, у 75% пациенток IIБ подгруппы выявлено соотношение ПР/ЭРα<2.
Во IIБ подгруппе наблюдалось достоверно значимое увеличение уровня экспрессии ПР в поверхностном эпителии и в железах (р<0,05), показатели ПР в строме не отличались от группы контроля. В то же время количество ЭРα в клетках поверхностного эпителия и желез превышало норму более чем в 2 раза, в клетках стромы – в 1,4 раза (рис. 4).
а б в
а - окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400, 15% клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий
б - ИГХ к ПР. H-score: поверхностный эпителий – 285, железы – 285, строма – 240
в - ИГХ к ЭРα. H-score: поверхностный эпителий – 270, железы – 270, строма – 170
Рисунок 4. Гиперэкспрессия ЭРα в фазу секреции (вариант дисбаланса ПР/ЭРα<2)
Известно, что в эндометрии снижение ЭРα - критическое событие, освобождающее от подавляющего влияния определенные гены и обеспечивающее сигнал для начала внутриматочной рецептивности. Высоко специализированный и специфический средне-секреторный репертуар эндометриальной экспресси геннов совпадает с сокращением экспрессии ЭРα (Talbi S, 2006). Гиперэкспрессия ЭРα в лютеиновую фазу цикла вызывает нарушение экспрессии биологических маркеров имплантации, в том числе интегрина αvβ3 (Lessey, 2006; Donaghay, 2007). Отсутствие физиологического снижения ЭРα в средне-секреторную фазу МЦ может быть связано с неадекватными уровнями прогестерона в сыворотке крови, чрезмерной экспрессией ароматаз, коактиваторов стероидных рецепторов (Gregory CW, 2002), некоторых провоспалительных цитокинов (IL-6, EGF), а также, возможно, с нарушением экспрессии ЭРβ.
Следует отметить, что данная подгруппа женщин (IIБ) единственная, где не выявлено ни одной статистически значимой корреляции между концентрацией эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови и показателями экспрессии ПР и ЭРα. Дисбаланс экспрессии стероидных рецепторов в эндометрии на фоне нормального профиля сывороточных гормонов у таких пациенток может свидетельствовать о повреждении рецепторного аппарата на тканевом уровне или локальном нарушении функции паракринных и аутокринных факторов регулирующих экспрессию ЭРα. Возможно, наличие гиперэкспрессии ЭРα в середине лютеиновой фазы МЦ может быть лучшим биомаркером нарушения функции эндометрия у женщин с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе.
В IIВ группе (неполноценная фаза секреции) выявлено статистически значимое снижение уровня ПР в клетках поверхностного эпителия и стромы (более чем в 2 раза), а также наблюдалась тенденция к повышению уровня ЭРα в поверхностном эпителии и железах (р>0,05) по сравнению с группой контроля.
Среди пациенток II группы, только у 8,5% пациенток обнаружено ≥50% пиноподий, в остальных 95,5% биоптатах этот показатель колебался от 0 до 30%. Среднее количество пиноподий во II группе было более чем в 3,5 раза меньше, чем у пациенток I группы и составило 18,3±1,9%.
В результате многофакторного анализа с использованием метода бинарной логистической регрессии была построена статистически значимая модель: y=0,167 — 0,17 * РП/РЭα поверхн. + 2,8 * РП/РЭα железы — 24,9 * РП/РЭα стромы (р<0,0005285), в которой показано, что на наступление беременности в программе ЭКО влияют показатели соотношения ПР/ЭРα в поверхностном эпителии, в железах и в строме эндометрия, однако, определяющим прогностическим фактором является соотношение ПР/РЭα в строме (коэффициент 24,9).
На основании полученных результатов также произведен расчет относительного шанса (ОШ) наступления беременности после ЭКО у пациенток с неэффективными попытками в анамнезе при различных показателях соотношения ПР/ЭРα в эндометрии. При соотношении ПР/ЭРα<2, ОШ отрицательного результата составил 9,43 (95% доверительный интервал 3,37-26,39). При соотношении ПР/ЭРα в диапазоне 2 – 3 (3>ПР/ЭРα≥2) ОШ наступления беременности составил 4,38 (95% доверительный интервал 2,31-8,29). При увеличении соотношения ПР/ЭРα более 3, ОШ наступления беременности уменьшается и составляет только 1,22, причем нижняя граница 95% доверительного интервала менее 1 (95% доверительный интервал 0,37-4,02), что говорит о статистически незначимом факте. Таким образом, шанс наступления беременности после ЭКО у данных пациенток при соотношении ПР/ЭРα в диапазоне 2-3 выше в 4,4 раза по сравнению с теми, у которых данная величина не входит в указанный диапазон (т.е. при ПР/ЭРα<2 и ПР/ЭРα>3).
Учитывая данные, полученные на первом этапе исследования, была сформирована III группа пациенток (n=35) с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе, у которых при ИГХ исследовании выявлено снижение уровня экспрессии ПР и ЭРα и которым целесообразно назначение препаратов эстрогена и прогестерона в качестве подготовки эндометрия перед следующей программой ЭКО. Так как у пациенток IIБ группы (с отсутствием снижения уровня ЭРα в фазу секреции) отсутствовали корреляционные связи между концентрациями стероидных гормонов и соответствующих рецепторов эндометрия, они не были включены в дальнейшее исследование.
До лечения в III группе фаза пролиферации наблюдалась у 54,3% пациенток (IIIА группа), фаза секреции у 31,4% (IIIБ группа) и неполноценная фаза секреции у 14,3% (IIIВ группа). До лечения в III группе количество пиноподий колебалось от 5 до 30 % и только у 2,9% пациенток обнаружено количество пиноподий ≥50%, среднее значение составило 21,4±1,9%.
В IIIА подгруппе женщин средние показатели экспрессии ПР составили в клетках поверхностного эпителия и желез 91,3±14,5, в строме – 81,3±10,3 баллов. Количество ЭРα составило в среднем 60,3±16 в поверхностном эпителии и железах, 49,5±10,9 в строме.
До лечения в IIIБ группе пациенток, у которых по данным гистологического исследования выявлена фаза секреции, также наблюдался низкий уровень стероидной рецепции (<100 баллов) во всех клетках эндометрия. Уровень ПР составил в среднем в клетках поверхностного эпителия 50±11, в железах - 62,7±11,9, в строме - 100,9±10,6 баллов. Средние значения уровня экспрессии ЭРα составили в поверхностном эпителии – 34,6±7,9, в железах – 34,6±6,8, в строме – 22,3±5,8 баллов.
До лечения у пациенток с неполноценной фазой секреции (IIIВ подгруппа) наблюдалось неравномерная ИГХ реакция в клетках эндометрия и высокие колебания показателей ПР и ЭРα.
Таким образом, III группа была сформирована из пациенток со сниженной стероидной рецепцией. По данным ИГХ исследования до лечения показатели ПР в клетках поверхностного эпителия и желез были в 1,5 раза, в строме в 2 раза ниже чем уровни экспрессии ПР в группе контроля. Для показателей ЭРα наблюдалось статистически значимое (р<0,05) различие только в клетках стромы.
Пациенткам III группы в течение двух менструальных циклов перед программой ЭКО и ПЭ проводилась гормональная подготовка эндометрия препаратами трансдермального эстрадиола (с 5-го по 25-й день МЦ) и микронизированного прогестерона (с 16-го по 25-й день МЦ).
После проведенной гормональной подготовки в III группе пациенток во всех полученных биоптатах наблюдались равномерные секреторные преобразования. При этом у 14,3% пациенток количество клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий колебалось от 5 до 30%. У 31,4% женщин количество пиноподий составило 50%, у 54,3% пациенток – от 60 до 100%, среднее значение - 58,9±3,7%. После проведенного гормонального лечения наблюдалось статистически значимое увеличение количества клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий (р<0,05), а показатели ПР в клетках поверхностного эпителия и желез и составили в среднем 179,9±9,3, в строме - 215,1±6,1 баллов. Количество ЭРα в среднем составило в поверхностном эпителии 88,3±6,1, в железах - 88±6,1, в строме - 97,4±3,1.
В III группе после проведенного лечения соотношение ПР/ЭРα≥2 во всех клетках эндометрия наблюдалось у 80% пациенток, у 8,6% - было соотношение ПР/ЭРα<2 во всех клетках эндометрия, у 11,4% женщин в строме наблюдалось соотношение ПР/ЭРα≥2, а в поверхностном эпителии и железах ПР/ЭРα<2. В среднем ПР/ЭРα в III группе после проведенного лечения составило в поверхностном эпителии 2,1±0,1, в железах – 2,1±0,1, в строме – 2,3±0,1.
Также наблюдалось статистически значимое (р<0,05) увеличение показателей ПР и ЭРα во всех клетках эндометрия. В поверхностном эпителии, железах и строме показатели ПР увеличились более чем в 2 раза. Уровень экспрессии ЭРα повысился в 1,6 раза в поверхностном эпителии и железах и более чем в 2 раза в клетках стромы. Данные гистологического исследования свидетельствуют о нормализации структурно-функционального состояния эндометрия, формировании более полноценных морфологических реакций поверхностного эпителия, железистого и стромального компонентов эндометрия у данной категории пациенток на фоне гормональной подготовки. Полученные результаты говорят в пользу того, что циклическая гормональная терапия обеспечивает адекватное поступление половых стероидных гормонов и повышает чувствительность к ним клеток эндометрия путем увеличения экспрессии прогестероновых и эстрогеновых рецепторов, что позволяет гормонам реализовать их действие в виде адекватной и равномерной морфо-функциональной реакции оболочки матки.
В III группе пациенток (n=35) после предварительной гормональной подготовки эндометрия в результате программы ЭКО беременность наступила у 74,3% женщин (n=26).
Следует отметить, что беременность наступила у всех пациенток, у которых до лечения была выявлена фаза пролиферации и соотношение ПР/ЭР<2 или фаза секреции и соотношение ПР/ЭР≥2.
Таким образом, полученные в ходе выполнения данного исследования результаты свидетельствуют о несомненной связи между состоянием эндометрия и эффективностью реализации программы ЭКО, что диктует необходимость исследования эндометрия на этапе подготовки.
На основании полученных результатов разработан алгоритм индивидуальной предварительной подготовки эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе к последующей программе (рис. 5).
Рисунок 5. Алгоритм предварительной гормональной подготовки эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе
ВЫВОДЫ
1. При сходных клинико-анамнестических характеристиках, параметрах фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в 66,1% случаев выявляются структурные изменения эндометрия.
2. При отрицательном результате ЭКО более чем в 6 раз чаще отмечено отсутствие характерных для «окна имплантации» морфологических изменений эндометрия и снижение более чем в 3,5 раза количества клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий в эндометрии.
3. При повторных неудачах имплантации наблюдаются различные варианты дисбаланса экспрессии ПР и ЭРα в эндометрии (снижение стероидной рецепции или гиперэкспрессия ЭРα), наиболее выраженные в строме. Относительный шанс наступления беременности после ЭКО при этом в 4,4 раза выше при соотношении ПР/ЭРα в диапазоне от 2 до 3.
4. Основными прогностически благоприятными критериями наступления беременности являются соотношение ПР/ЭРα, соответствующее морфологической структуре эндометрия, и количество клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий ≥50%, а наиболее неблагоприятным - персистирующая гиперэкспрессия ЭРα в среднелютеиновую фазу менструального цикла.
5. Проведение морфологической и иммуногистохимической оценки эндометрия позволяет выделить группу пациенток со сниженными показателями экспрессии ПР и ЭРα, которым необходимо и целесообразно проведение циклической гормональной подготовки перед программой ЭКО с использованием препаратов эстрадиола и прогестерона.
6. Проведение предварительной циклической гормональной терапии при сниженном уровне экспрессии ПР и ЭРα в эндометрии у пациенток с неэффективными попытками ЭКО позволяет увеличить частоту наступления беременности до 74,3%.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Пациенткам с неудачами имплантации в анамнезе перед проведением программы ЭКО и ПЭ необходимо проведение морфологического и иммуногистохимического исследования эндометрия с целью выявления патологических изменений рецепторного статуса (снижение уровня экспрессии ПР и ЭРα, не соответствующее морфологической структуре эндометрия, гиперэкспрессия ЭРα в фазу секреции) для определения индивидуальной подготовки к следующему циклу ЭКО.
2. При гистологическом исследовании эндометрия в период «окна имплантации» рекомендуется с помощью световой микроскопии оценивать морфологическую структуру поверхностного эпителия.
3. При определении в биоптате эндометрия фазы пролиферации в сочетании с ПР/ЭРα<2 и низкой или умеренной экспрессией ПР и ЭРα, а также фазы секреции в сочетании с ПР/РЭα≥2, низкой экспрессией ПР в строме и низкой экспрессией ЭРα и количеством пиноподий <50% следует проводить предварительную гормональную подготовку с применением препаратов эстрадиола (с 5-го по 25-й день МЦ) и прогестерона (с 16-го по 25-й день МЦ) в течение двух МЦ.
4. У пациенток с соотношением ПР/ЭРα<2 при морфологической картине ранней или средней стадии фазы секреции проведение циклической гормональной терапии с использованием препаратов эстрадиола и прогестерона нецелесообразно.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВРТ – вспомогательные репродуктивные технологии
ГнРГ – гонадотропин релизинг гормона
Е2 – эстрадиол
ИГХ – иммуногистохимический
ЛГ – лютеинизирующий гормон
ОШ – относительный шанс
ПР – прогестероновые рецепторы
ПЭ – перенос эмбриона
рФСГ – рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон
ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение
ЭРα – эстрогеновые рецепторы α
ЭРβ – эстрогеновые рецепторы β
EGF – эпидермальный фактор роста
IL - интерлейкин
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Калинина, Е.А. Применение пероральных контрацептивов в программе экстракорпорального оплодотворения [Текст] / Е.А. Калинина, Е.В. Дюжева // Акушерство и гинекология. – 2009. - №2. – С. 11 – 13.
2. Дюжева, Е.В. Иммуногистохимическое исследование эндометрия в программах ВРТ [Текст] / Е.В. Дюжева, Е.А. Калинина, Л.Н. Кузьмичев, Е.А. Коган // Вестник РУДН серия Медицина Акушерство и гинекология. – 2009. - №6. – С. 98 – 104.
3. Дюжева, Е.В. Гормональная подготовка с учетом морфофункционального состояния эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе [Текст] / Е.В. Дюжева, Е.А. Калинина, Е.А., Коган Л.Н. Кузьмичев // IV Международный конгресс по репродуктивной медицине. – Москва, 2010. – С. 255 - 256.
4. Dioujeva, Е.V. Morphological and immunohistochemistry features of the endometrium in patients with multiple failed IVF-ET cycles [Text] / Е.V. Dioujeva, Е.А. Каlinina, L.N. Кuzmichev, N.N. Volchenko // The 3rd International IVI Congress. – Madrid, 2009. – P. 80.
5. Kulakova, Е.V. The predictive value of the correlation between progesterone and estrogen receptors in endometrium in the period of «the implantation window» in patients with repeated implantation failures [Text] / Е.V. Kulakova, Е.V. Dyuzheva, Е.А. Коgan, Е.А. Каlinina, М.B. Strelchenko, L.N. Кuzmichev // The 3rd Asia Pacific Congress on Controversies in Obstetrics Gynecology and Infertility. – 2009. – Beijing. – P. 1А – 2А.