С-реактивный белок

С-РЕАКТИВНЫЙ БЕЛОК: ФАКТОР ВОСПАЛЕНИЯ, СВЯЗЫВАЮЩИЙ И ИНАКТИВИРУЮЩИЙ АЦЕТИЛХОЛИН
П.Г. Назаров, И.Б. Крылова, Н.Р. Евдокимова, Г.И. Нежинская, А.А. Бутюгов
С-реактивный белок (CRP), маркер воспаления и защитный фактор врожденного иммунитета, связывает фосфорилхолин (ФХ) и ФХ-содержащие вещества. Основываясь на структурном сходстве между ФХ и ацетилхолином (АХ), исследовали способность очищенного CRP человека связывать АХ, влиять на его физиологическую активность и расщепление ацетилхолинэстеразой. Результаты показали, что CRP связывает АХ. У крыс CRP значительно снижал сердечно-сосудистую реакцию на введение АХ, а in vitro связывал АХ и защищал от гидролиза ферментом. Влияние CRP на сердечно-сосудистую систему может реализоваться через АХ-зависимые механизмы. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 4. С. 32-35.)
Пентраксины — это семейство гомологичных белков человека и животных, состоящих из пяти субъединиц и связывающих определенные лиганды. Такие пентраксины, как С-реактивный белок (CRP) и сывороточный P-компонент амилоида (SAP), являются маркерами острой фазы воспаления и играют защитную роль в реакциях врожденного иммунитета. Одна из функций CRP состоит в связывании и поврежденных и вредных продуктов — компонентов клеточного детрита, нуклеопротеинов, бактериальных токсинов, модифицированных липопротеинов [1-3]. Основными лигандами CRP и SAP являются фосфорилхолин (ФХ) и ФХ-содержащие соединения. После связывания с пентраксином они разрущаются комплементом и элиминируются путем фагоцитоза.
ФХ структурно сходен с ацетилхолином (АХ), парасимпатическим нейромедиатором: оба вещества имеют холиновое ядро, соединенное с фосфатом или ацетатом. Несмотря на сходство ФХ и АХ, в литературе нет работ, касающихся сродства пентраксинов к АХ. АХ не упоминался среди лигандов CRP. Вместе с тем, некоторые фосфолипиды (лизофосфатидилхолин, сфингозин, лизо-тромбоцитактивирующий фактор (lyso-PAF)) проявляют холинолитическиую активность, т. е. связываются с ацетилхолиновыми рецепторами (АХР) и конкурируют с АХ, блокируя его физиологическую активность [9, 15].
В литературе обсуждается патогенетическая роль CRP в развитии сердечно-сосудистой тромбоэмболической патологии. Считают, что CRP — фактор атерогенеза, способствующий формированию атеросклеротических бляшек и развитию тромбозов [11]. У лиц с повышенным уровнем CRP снижен сосудистый ответ на инфузию АХ [5]. Можно допустить, что CRP способен связывать АХ и ограничивать его влияние на сердечно-сосудистую систему.
Цель работы — исследовать, влияет ли CRP на физиологическую активность АХ in vivo и, если да, то каким путем. Проведены следующие исследования: 1) опыты на животных по выяснению влияния CRP на основные виды активности АХ — способность понижать артериальное давление и вызывать брадикардию; 2) опыты in vitro по выяснению связывания АХ с CRP с оценкой защиты АХ от разрушения ацетилхолинэстеразой и с оценкой электрофоретической подвижности комплексов CRP-АХ.
Материалы и методы
Использовали препараты следующих фирм: ацетилхолин хлорид (АХ) — Казанского химфармзавода; очищенный С-реактивный белок человека (CRP) — ICN (USA) и RDI (USA); аденозин (Адо) и ацетилхолинэстеразу (АХЭ; EC 3.1.1.7) — ICN (USA); нормальный гамма-глобулин человека (IgG) — НИИЭМ им. Пастера (Санкт-Петербург); фосфорилхолин хлорид (ФХ) — Sigma (USA); пневмококковый С-полисахарид — Reanal (Hungary); реагенты для метода Хестрина и электрофореза в геле агарозы (гидроксиламин, FeCl3, HCl, NaOH, дитионитробензойная кислота, маркеры молекулярной массы и др.) — ICN (USA), Helicon (USA) и «Вектон» (Санкт-Петербург).
Животные и схема опытов. Опыты проведены на крысах-самцах Wistar (Питомник РАМН «Рапполово», Санкт-Петербург), массой 280-330 г (в возрасте 7 нед.), под внутрибрюшинным наркозом этаминалом натрия (50 мг/кг массы тела, растворитель — забуференный физиологический раствор NaCl (ЗФР)). Вводили 2 катетера: один в бедренную артерию для регистрации артериального давления (АД), другой в бедренную вену для введения препаратов. После 30-минутного стабилизационного периода получали ответ на гипотензивные агенты — АХ и Адо. Гипотензивный ответ оценивали по процентному снижению АД по сравнению с индивидуальным фоновым АД. Влияние препаратов на сердечный ритм оценивали по частоте сердцебиений — по максимальному изменению длины интервала R-R на электрокардиограмме (ЭКГ) во втором отведении при скорости записи 50 мм/сек на приборе ЭК1Т-03М2.
Как известно, АД и интервал R-R нормализуются после введения АХ без десенсибилизации рецепторов, не влияя на характер сердечно-сосудистой реакции на повторное введение АХ. Это определило схему опытов. Каждая крыса получала две инъекции вазорелаксанта с интервалом 20 мин. После 1-й инъекции регистрировали исходную сердечно-сосудистую реакцию; через 20 мин вводили тот же релаксант повторно, в той же дозе, но теперь в виде смеси с CRP, IgG или ЗФР, и снова регистрировали сердечно-сосудистую реакцию. Минимальные эффективные дозы АХ и Адо были подобраны в предварительных опытах: оба препарата вводили по 2,5 мкг/кг в 0,1 мл ЗФР.
Группы животных: 1) 1-я инъекция — АХ, 2-я — АХ, смешанный и инкубированный в течение 15 мин при комнатной температуре с 0,1 мл ЗФР (контроль) либо с 0,3 мл CRP (650 мкг/мл); 2) 1-я инъекция — АХ, 2-я — АХ, смешанный и инкубированный, как указано выше, с IgG человека (0,3 мл, 650 мкг/мл); 3) 1-я — Адо, 2-я — Адо в смеси с 0,1 мл ЗФР либо с 0,3 мл CRP (650 мкг/мл); 4) 1-я инъекция — Адо, 2-я — Адо в смеси с IgG человека (0,3 мл, 650 мкг/мл).
При расчете дозы CRP, вводимого животным, за основу был принят известный факт, что молекула CRP связывает 5 молекул ФХ. В случае введения смеси АХ с CRP крысы получали по 2 нМ CRP и по 5 нМ АХ. Это соответствовало молярному отношению CRP к АХ 1:2,5 и 2-кратному молярному избытку ФХ-связывающих сайтов CRP над АХ.
Оценку гидролиза АХ ацетилхолинэстеразой (АХЭ) в присутствии CRP или IgG проводили гидроксиламиновой реакцией Хестрина [7] с регистрацией на ридере Spektra-III (Austria) при 570 нм. Рабочая концентрация АХЭ составляла 1 мг/мл.
Электрофорез в геле агарозы проводили без додецилсульфата натрия. CRP, АХ, ФХ, C-полисахарид и АХЭ растворяли в растворе Хэнкса, содержащем ионы кальция.
Статистическая обработка данных. Данные представлены в виде средних арифметических (М) и ошибок средних (SEM). Различия между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Комментариев пока нет.

Добавить комментарий


About Беркегейм Михаил

Я родился 23 ноября 1945 года в Москве. Учился в школе 612. до 8 класса. Мама учитель химии. Папа инженер. Я очень увлекался химией и радиоэлектроникой. Из химии меня очень увлекала пиротехника. После взрыва нескольких помоек , я уже был на учете в детской комнате милиции. У меня была кличка Миша – химик. Из за этого после 8 класса дед отвел меня в 19 мед училище. Где меня не знали. Мой отчим был известный врач гинеколог. В 1968 году я поступил на вечерний факультет медицинского института. Мой отчим определил мою профессию. Но увлечение электроникой не прошло, и я получил вторую специальность по электронике. Когда я стал работать врачом гинекологом в медицинском центре «Брак и Семья» в 1980 году, я понял., что важнейшим моментом в лечении бесплодия является совмещение по времени секса и овуляции. Мне было известно, что овуляция может быть в любое время и несколько раз в месяц. И самое главное, что часто бывают все признаки овуляции. Но ее не происходит. Это называется псевдоовуляция. Меня посетила идея создать прибор надежно определяющий овуляцию. На это ушло около 20 лет. Две мои жены меня не поняли. Я мало времени уделял семье. Третья жена уже терпит 18 лет. В итоге прибор получился. Этот прибор помог вылечить бесплодие у очень многих женщин…
×
Записаться на приём или задать вопрос