С-РЕАКТИВНЫЙ БЕЛОК: ФАКТОР ВОСПАЛЕНИЯ, СВЯЗЫВАЮЩИЙ И ИНАКТИВИРУЮЩИЙ АЦЕТИЛХОЛИН
П.Г. Назаров, И.Б. Крылова, Н.Р. Евдокимова, Г.И. Нежинская, А.А. Бутюгов
С-реактивный белок (CRP), маркер воспаления и защитный фактор врожденного иммунитета, связывает фосфорилхолин (ФХ) и ФХ-содержащие вещества. Основываясь на структурном сходстве между ФХ и ацетилхолином (АХ), исследовали способность очищенного CRP человека связывать АХ, влиять на его физиологическую активность и расщепление ацетилхолинэстеразой. Результаты показали, что CRP связывает АХ. У крыс CRP значительно снижал сердечно-сосудистую реакцию на введение АХ, а in vitro связывал АХ и защищал от гидролиза ферментом. Влияние CRP на сердечно-сосудистую систему может реализоваться через АХ-зависимые механизмы. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 4. С. 32-35.)
Пентраксины — это семейство гомологичных белков человека и животных, состоящих из пяти субъединиц и связывающих определенные лиганды. Такие пентраксины, как С-реактивный белок (CRP) и сывороточный P-компонент амилоида (SAP), являются маркерами острой фазы воспаления и играют защитную роль в реакциях врожденного иммунитета. Одна из функций CRP состоит в связывании и поврежденных и вредных продуктов — компонентов клеточного детрита, нуклеопротеинов, бактериальных токсинов, модифицированных липопротеинов [1-3]. Основными лигандами CRP и SAP являются фосфорилхолин (ФХ) и ФХ-содержащие соединения. После связывания с пентраксином они разрущаются комплементом и элиминируются путем фагоцитоза.
ФХ структурно сходен с ацетилхолином (АХ), парасимпатическим нейромедиатором: оба вещества имеют холиновое ядро, соединенное с фосфатом или ацетатом. Несмотря на сходство ФХ и АХ, в литературе нет работ, касающихся сродства пентраксинов к АХ. АХ не упоминался среди лигандов CRP. Вместе с тем, некоторые фосфолипиды (лизофосфатидилхолин, сфингозин, лизо-тромбоцитактивирующий фактор (lyso-PAF)) проявляют холинолитическиую активность, т. е. связываются с ацетилхолиновыми рецепторами (АХР) и конкурируют с АХ, блокируя его физиологическую активность [9, 15].
В литературе обсуждается патогенетическая роль CRP в развитии сердечно-сосудистой тромбоэмболической патологии. Считают, что CRP — фактор атерогенеза, способствующий формированию атеросклеротических бляшек и развитию тромбозов [11]. У лиц с повышенным уровнем CRP снижен сосудистый ответ на инфузию АХ [5]. Можно допустить, что CRP способен связывать АХ и ограничивать его влияние на сердечно-сосудистую систему.
Цель работы — исследовать, влияет ли CRP на физиологическую активность АХ in vivo и, если да, то каким путем. Проведены следующие исследования: 1) опыты на животных по выяснению влияния CRP на основные виды активности АХ — способность понижать артериальное давление и вызывать брадикардию; 2) опыты in vitro по выяснению связывания АХ с CRP с оценкой защиты АХ от разрушения ацетилхолинэстеразой и с оценкой электрофоретической подвижности комплексов CRP-АХ.
Материалы и методы
Использовали препараты следующих фирм: ацетилхолин хлорид (АХ) — Казанского химфармзавода; очищенный С-реактивный белок человека (CRP) — ICN (USA) и RDI (USA); аденозин (Адо) и ацетилхолинэстеразу (АХЭ; EC 3.1.1.7) — ICN (USA); нормальный гамма-глобулин человека (IgG) — НИИЭМ им. Пастера (Санкт-Петербург); фосфорилхолин хлорид (ФХ) — Sigma (USA); пневмококковый С-полисахарид — Reanal (Hungary); реагенты для метода Хестрина и электрофореза в геле агарозы (гидроксиламин, FeCl3, HCl, NaOH, дитионитробензойная кислота, маркеры молекулярной массы и др.) — ICN (USA), Helicon (USA) и «Вектон» (Санкт-Петербург).
Животные и схема опытов. Опыты проведены на крысах-самцах Wistar (Питомник РАМН «Рапполово», Санкт-Петербург), массой 280-330 г (в возрасте 7 нед.), под внутрибрюшинным наркозом этаминалом натрия (50 мг/кг массы тела, растворитель — забуференный физиологический раствор NaCl (ЗФР)). Вводили 2 катетера: один в бедренную артерию для регистрации артериального давления (АД), другой в бедренную вену для введения препаратов. После 30-минутного стабилизационного периода получали ответ на гипотензивные агенты — АХ и Адо. Гипотензивный ответ оценивали по процентному снижению АД по сравнению с индивидуальным фоновым АД. Влияние препаратов на сердечный ритм оценивали по частоте сердцебиений — по максимальному изменению длины интервала R-R на электрокардиограмме (ЭКГ) во втором отведении при скорости записи 50 мм/сек на приборе ЭК1Т-03М2.
Как известно, АД и интервал R-R нормализуются после введения АХ без десенсибилизации рецепторов, не влияя на характер сердечно-сосудистой реакции на повторное введение АХ. Это определило схему опытов. Каждая крыса получала две инъекции вазорелаксанта с интервалом 20 мин. После 1-й инъекции регистрировали исходную сердечно-сосудистую реакцию; через 20 мин вводили тот же релаксант повторно, в той же дозе, но теперь в виде смеси с CRP, IgG или ЗФР, и снова регистрировали сердечно-сосудистую реакцию. Минимальные эффективные дозы АХ и Адо были подобраны в предварительных опытах: оба препарата вводили по 2,5 мкг/кг в 0,1 мл ЗФР.
Группы животных: 1) 1-я инъекция — АХ, 2-я — АХ, смешанный и инкубированный в течение 15 мин при комнатной температуре с 0,1 мл ЗФР (контроль) либо с 0,3 мл CRP (650 мкг/мл); 2) 1-я инъекция — АХ, 2-я — АХ, смешанный и инкубированный, как указано выше, с IgG человека (0,3 мл, 650 мкг/мл); 3) 1-я — Адо, 2-я — Адо в смеси с 0,1 мл ЗФР либо с 0,3 мл CRP (650 мкг/мл); 4) 1-я инъекция — Адо, 2-я — Адо в смеси с IgG человека (0,3 мл, 650 мкг/мл).
При расчете дозы CRP, вводимого животным, за основу был принят известный факт, что молекула CRP связывает 5 молекул ФХ. В случае введения смеси АХ с CRP крысы получали по 2 нМ CRP и по 5 нМ АХ. Это соответствовало молярному отношению CRP к АХ 1:2,5 и 2-кратному молярному избытку ФХ-связывающих сайтов CRP над АХ.
Оценку гидролиза АХ ацетилхолинэстеразой (АХЭ) в присутствии CRP или IgG проводили гидроксиламиновой реакцией Хестрина [7] с регистрацией на ридере Spektra-III (Austria) при 570 нм. Рабочая концентрация АХЭ составляла 1 мг/мл.
Электрофорез в геле агарозы проводили без додецилсульфата натрия. CRP, АХ, ФХ, C-полисахарид и АХЭ растворяли в растворе Хэнкса, содержащем ионы кальция.
Статистическая обработка данных. Данные представлены в виде средних арифметических (М) и ошибок средних (SEM). Различия между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.