Сифилис TPHA

Диагностика сифилиса
 
БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Наиболее убедительным доказательством трепонемной природы заболевания является прямая визуализация трепонем. В настоящее время метод тёмнопольной микроскопии для выявления подвижных трепонем широко применяется в диагностике. При первичном сифилисе на бледную трепонему исследуют отделения эрозивно-язвенных папулёзных элементов в области половых органов, полости рта, в пунктате из регионарных лимфатических узлов. При вторичном сифилисе используется материал из различных поражений кожи и слизистых оболочек. Для диагностики врожденного сифилиса может быть использована амниотическая жидкость. При микроскопическом исследовании бледные трепонемы имеют вид тонкой спирали с 8 -12 равномерными завитками. В тёмном поле зрения можно наблюдать поступательное вращение трепонемы вокруг оси, ротационное и сгибательное. Важным признаком является излом в средней части («приглаженный утюгом»), что отличает возбудителя сифилиса от других трепонем. При отрицательных результатах микроскопическое исследование повторяют либо до обнаружения бледной трепонемы, либо до подтверждения диагноза результатами серологического исследования. Обнаружение специфических микроорганизмов с характерной морфологией, подвижностью и антигенной специфичностью (при исключении таких заболеваний, как пинта и мягкий шанкр) позволяет поставить диагноз сифилиса при первичном, вторичном, раннем врождённом, рецидивном сифилисе даже без учёта результатов серологических тестов. Следует учитывать, что отсутствие микроорганизмов ещё не исключает диагноз сифилиса. Отсутствие трепонем в типичных очагах поражения может быть обусловлена длительностью существования очага, предварительным лечением пациента или плохой техникой взятия образца или просмотра материала. При отсутствии возбудителей в очаге поражения следует исключить возможность других заболеваний (герпес, мягкий шанкр). СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ Все существующие в настоящее время лабораторные серологические тесты можно разделить на две группы: — нетрепонемные тесты, используемые для отбора; — трепонемные подтверждающие тесты. Сложность клинического течения сифилиса диктует необходимость сочетанного применения диагностических тестов. Прямое определение патогенных T.pallidum в очагах поражения (прямая визуализация — бактериоскопическое исследование) позволяет достоверно поставить диагноз при первичном, вторичном и раннем врожденном сифилисе. Нетрепонемные тесты (НТТ) используются в качестве отборочных, они недороги, позволяют обследовать большое количество больных и необходимы для определения эффективности терапии. Ограничением нетрепонемных тестов является низкая чувствительность при первичном и третичном сифилисе, снижение чувствительности при позднем латентном сифилисе, наличие ложноположительных результатов. Трепонемные тесты (ТТ) обычно не применяются для отбора, так как они технически сложны и дороги по сравнению с нетрепонемными. Они используются для подтверждения результатов нетрепонемных тестов, особенно при отсутствии клинически выраженных симптомов заболевания. Подтверждение диагноза позднего латентного, третичного сифилиса при отрицательных результатах нетрепонемных тестов также проводится с помощью трепонемных тестов, хотя их чувствительность уменьшается с течением заболевания. В будущем, по-видимому, с этой целью будет использоваться полимеразная цепная реакция. Развитие методов иммунологии и молекулярной биологии привело к появлению в течение последнего десятилетия большого количества новых тестов, некоторые из них, например, иммуноферментный анализ (ИФА), прочно заняли место в практике. Такие методики прямого определения трепонемных антигенов, как полимеразная цепная реакция, метод молекулярных зондов, основанные на методах молекулярной биологии, находятся в стадии разработки. Серологические исследования имеют важнейшее значение для диагностики сифилиса, особенно в латентной и поздней стадиях, а также для оценки качества проводимого лечения. Однако вследствие сложности антигенного состава бледной трепонемы, тело которой содержит два липоидных компонента, протеиновые и полисахаридные антигены, в сыворотке крови больных отмечается множественность антител. В различных стаднях болезни преобладают то одни, то другие антитела, относящиеся к разным классам иммуноглобулинов. Поэтому в современной венерологии одновременно используется несколько серологических реакций на сифилис. Нетрепонемные тесты позволяют обнаружить в тестируемой сыворотке антитела, реагирующие с кардиолипин-лецитиновым антигеном. Первым нетрепонемным тестом был серологический тест, основанный на реакции фиксации комплемента Борде-Жангу, где в качестве антигена использовался спиртовой экстракт печени новорожденного, умершего от врожденного сифилиса (реакция Вассермана). Все нетрепонемные тесты на сифилис, применяемые в настоящее время, представляют собой реакции флоккуляции (продукт выпадает в виде хлопьев), в которых в качестве антигена используются кардиолипин, холестерин и лецитин. Все нетрепонемные тесты направлены на обнаружение IgG- и IgM-антител к липидам клеточной стенки трепонем. Вследствие липидной природы антигена или необычных свойств антител при этих тестах комплекс антиген-антитело остается в суспензии, и имеет место флоккуляция, а не агглютинация или преципитация. За рубежом (США) используются 4 стандартных нетрепонемных теста в качестве отборочных реакций на сифилис, среди которых различают две категории: 1) Тесты с визуальным определением результатов реакции — RPR (тест быстрых плазменных реагинов) и TRUST (тест с толуидиновым красным); 2) Тесты с микроскопическим считыванием результатов реакции — VDRL и USR (тест определения активных реагинов плазмы). RPR (Rapid Plasma Reagins) — тест быстрых плазменных реагинов и его автоматизированная модификация — автоматизированный реагиновый тест (ART, Automated Reagin Test). Эти тесты могут считываться визуально из-за наличия окрашенных веществ в приготовленном антигене. Тест RPR был разработан для полевых условий и сейчас это наиболее распространенный нетрепонемный тест. Он проводится на пластиковых планшетках с впечатанными кружочками. При постановке количественной или качественной модификаций реакции стандартные количества неразведенной сыворотки или ее серийных разведений смешиваются с антигеном, содержанием частицы угля. Планшету с антигеном и сывороткой вращают при 1000 об/мин в течение 8 мин. Антиген не прикрепляется к этим частицам, но при наличии в сыворотке антикардиолипиновых антител происходит флоккуляция комплексов антиген-антитело, частицы угля как бы попадают в ловушку в образовавшуюся сеть и коагулируют. Результаты теста читаются во влажном месте при ярком тесте немедленно после проведения реакции. В тесте используется непрогретая сыворотка. TRUST (Toluidin Red Unheated Serum Test) — тест с толуидиновым красным и непрогретой сывороткой. В данном тесте стандартные частицы азокрасителя толуидинового красного добавляются к основному стабилизированному антигену, причем визуализация выражена лучше, чем при добавлении частиц угля в RPR. В настоящее время тест TRUST широко не используется. VDRL (по названию лаборатории-разработчика — Venereal Disease Research Laboratory). В данном тесте свежеприготовленный антиген и инактивированная сыворотка смешиваются в стеклянной лунке механическим вращением. Если в сыворотке присутствуют антитела к кардиолипиновому антигену, образуются агрегаты в виде коротких стержневидных структур, выявляемые микроскопически. Используется количественная модификация VDRL до разведений сыворотки 1:64. VDRL является единственным тестом, рекомендуемым для исследования спинномозговой жидкости. USR (Unheated Serum Reagins) — тест определения активных реагинов плазмы. Антиген данного теста немного дороже антигена VDRL, однако, он стабилизирован добавлением холина хлорида и ЭДТА и не нуждается в ежедневном приготовлении. К нетрепонемным тестам относится также метод непрямого ИФА с кардиолипиновым антигеном. В отечественной практике в качестве отборочных нетрепонемных тестов применяются микрореакция с плазмой и инактивированной сывороткой (MP) и реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (РСК). Характеристика всех нетрепонемных тестов, используемых в настоящее время, похожа. Все они относительно нетрудоемки и просты в исполнении. Чувствительность всех тестов примерно такая, как при постановке VDRL (около 70% — при первичном сифилисе и 100% — при вторичном). Нетрепонемные тесты менее чувствительны при первичном и латентном сифилисе. Антитела, определяемые нетрепонемными тестами, обычно появляются через 1- 4 недели после формирования шанкра (примерно через 1-1,5 месяца после инфицирования). У большинства больных нетрепонемные реакции становятся практически отрицательными в течение первого года после лечения первичного сифилиса. Трепонемные тесты применяются для подтверждения результатов отборочных реакций, а также в тех случаях, когда скринирующие тесты дают отрицательные результаты, а клинические данные позволяют предполагать наличие сифилитической инфекции. Примерно у 85% больных после полноценного лечения сифилиса трепонемные тесты остаются положительными в течение нескольких лет, а у некоторых — в течение всей жизни, вследствие чего эти тесты не рекомендуются использовать при контроле излеченности. В отечественной практике для диагностики сифилиса применяют комплекс серологических реакций, включающий: 1) Стандартные серологические реакции — реакции связывания комплемента — (реакция Вассермана) реакция с кардиолипиновым антигеном; реакция с трепонемным антигеном. 2) Групповые трепонемные реакции: — реакция иммунофлюоресценции (РИФ); реакция иммунного прилипания (РИП). 3) Видоспецифические протеиновые трепонемные реакции: РИТ (реакция иммобилизации бледных трепонем); РИФ-абс и её варианты (IgM-FTA-ABS, 19S-IgM-FTA-ABS); реакция пассивной гемагглюцинации бледных трепонем (РПГА). Комплекс серологических реакций (КСР) позволяет выявить значительное число больных сифилисом на разных стадиях заболевания. Реакция Вассермана основана на феномене связывания комплемента. В постановке реакции используют как специфические антигены из бледных трепонем, так и неспецифические антигены (кардиолипиновый — экстракт из мышцы бычьего сердца). Степень позитивности реакции Вассермана оценивают числом плюсов: ++++ (резко положительная) +++ (положительная) ++ (слабоположительная) + (сомнительная) — (отрицательная) Реакция Вассермана обязательно применяется в комплексе с двумя осадочными реакциями (Кана и Закс-Витебского). Иммунологическая сущность этих реакций не отличается от РВ, но для них готовят более концентрированные антигены, которые при взаимодействии с реагинами сыворотки дают видимый осадок, оцениваемый качественно (++++, +++, ++, +, -). Диагноз первичного серонегативного сифилиса ставят только при отрицательных стандартных серологических реакциях. Реакция Вассермана (РВ) становится положительной у 100% больных во вторичном серопозитивном периоде сифилиса. При третичном активном сифилисе КСР положительны у 65-70% пациентов. При поздних формах сифилиса внутренних органов и нервной системы КСР положительны у 50-80% больных. У больных ранним врождённым сифилисом серологические реакции положительны почти в 100% случаев. При позднем врождённом сифилисе КСР положительны в 75-80% случаев. К специфическим серологическим реакциям относится реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Принцип РИФ основан на выявлении флюоресцирующих антител, так как меченые флюорохромом антитела не теряют способности соединяться с соответствующим антигеном и тем самым обусловливают свечение препаратов в сине-фиолетовых лучах ртутно-кварцевой лампы. Отличительной чертой РИФ, по сравнению со стандартными серологическими реакциями, является более высокая чувствительность (РИФ бывает положительной уже в первичном серонегативном периоде сифилиса) при высокой специфичности. Отмечена ценность РИФ при выявлении больных со скрытыми и поздними формами сифилиса при отрицательных результатах РИТ. Реакция ставится в нескольких модификациях и наиболее ценной является РИФ-200, основным назначением которой считается не ранняя серодиагностика сифилиса, а распознавание неспецифических результатов КСР и серодиагностика скрытого сифилиса. Однако РИФ-200 не обладает абсолютной специфичностью, поэтому вопрос о наличии или отсутствии заболения должен решаться на совокупности клинических и других серологических данных. РИФ при вторичном сифилисе положительна в 100% случаев. При третичном активном сифилисе РИФ положительна у 92-100% пациентов. При поздних формах сифилиса внутренних органов и нейросифилиса РИФ положительна у 94-100% больных. У больных ранним и поздним врождённым сифилисом РИФ положительна в 100% случаев. РИФ очень медленно негативируется в процессе противосифилитической терапии. Вследствие этого она непригодна для контроля за ходом лечения. РИП (реакция иммунного прилипания) основана на том, что вирулентные тканевые трепонемы, сенсибилизированные сывороткой больного сифилисом, в присутствии комплемента и эритроцитов прилипают к поверхности эритроцитов и при центрифугировании увлекаются с ними в осадок, исчезая из надосадочной жидкости. Оценка результатов реакции иммунного прилипания бледных трепонем следующая: 0 — 20% — отрицательная; 21 — 30% — сомнительная; 31 — 50% — слабоположительная; 51 — 100% — положительная. По специфичности и чувствительности РИП близка к РИТ и РИФ. РИП применяется в следующих случаях: — когда на основании данных анамнеза, клиники и результатов КСР и других исследований не удаётся подтвердить диагноз заболевания; — при дифференцировании неспецифических результатов КСР; — при контрольном наблюдении после окончания лечения. РИТ (реакция иммобилизации бледных трепонем) является диагностически ценной и признана самым специфичным тестом на сифилис. Однако её применение ограничивается из-за дороговизны исследований и сложности проведения реакции. Постановка РИТ имеет особое значение при диагностике скрытого сифилиса, распознавании поражений внутренних органов и нервной системы, при обследованиях беременных с подозрением на сифилис. Сущность реакции заключается в потере подвижности бледными трепонемами в присутствии иммобилизинов испытуемой сыворотки и активного комплемента. Иммобилизины появляются в сыворотке крови больных позднее, чем другие антитела, и РИТ становится положительной позже стандартных серореакций и РИФ. Оценка результатов реакции проводится по проценту иммобилизации бледных трепонем: до 20% — отрицательная; 21 — 30% — сомнительная; 31 — 50% — слабоположительная; 51 -100% — положительная. В первичном периоде сифилиса РИТ у большинства больных отрицательная или слабоположительная. При вторичном свежем сифилисе РИТ даёт положительный результат более чем у половины больных, однако, процент иммобилизации трепонем невысокий (40-60%). Во вторичном рецидивном периоде сифилиса РИТ бывает положительной у 85-90% больных при выраженной степени иммобилизации (80-100%). При третичном сифилисе, при специфических поражениях внутренних органов, нервной системы, когда РВ часто отрицательная, РИТ даёт положительные результаты в 98—100% наблюдений (с высоким процентом иммобилизации). В связи с медленной негативацией в процессе противосифилитической терапии, РИТ непригодна для контроля за ходом лечения. При раннем врождённом сифилисе РИТ положительна у 90-98% детей, при позднем врождённом сифилисе — почти у 100% больных. Диагноз скрытого серо-позитивного сифилиса ставится только по положительным серореакциям крови с обязательным подтверждением их РИТ. Реакция иммунофлюоресценции абсорбции с бледной трепонемой (FTA-ABS) становится положительной примерно в начале 3-й недели после заражения, а у нелеченных больных она положительна почти в 100% случаев. Главные достоинства реакции — высокая специфичность и чувствительность. Положительная FTA-ABS может иметь решающее значение для диагностики сомнительных случаев, особенно при положительных реакциях VDRL, выявленных при скрининге. После заражения сифилисом уже на 2-й неделе вырабатываются трепонемоспецифические IgM, которые в процессе терапии и после её окончания вырабатываются всё меньше и в течение 2 лет перестают определяться. Для сифилидологов представляет интерес динамика этих антител после лечения. Поэтому для суждения об эффективности лечения предложены тесты, направленные на определение специфических IgM. С помощью методики РИФ с моноспецифическим конъюгатом против IgM стало возможным выявлять трепонемоспецифические lgM-антитела (IgM-FTA ABS). Однако при идентификации антител IgM к бледным трепонемам реакцией FTA-ABS с использованием конъюгата анти-IgM в качестве реагента выявлялись ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Реакция 19S IgM-FTA-ABS в этом отношении является наиболее точным и специфичным методом. Однако трудоёмкость и дороговизна теста ограничивают её применение. Микрогемагглютинация — Т. pallidum — гемагглютинационный тест для определения специфических антител к Treponema pallidum (микро-РПГА). В РПГА используются антигены из трепонем, поэтому он наиболее специфичен. Чувствительность и специфичность эквивалентна РИФ-абс. РПГА позволяет определить наличие антител в образцах, не реагирующих в реагиновых тестах. Позитивный образец, выявленный при скрининге, можно количественно оценить при использовании реагентов TPHA-nosticon.
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
Среди множества серологических методов одним из наиболее перспективных для разработки диагностических тест-систем на сифилис является иммуноферментный анализ (ИФА). В настоящее время наибольшее распространение получил непрямой вариант ИФА, на заключительном этапе которого используются антивидовые AT к иммуноглобулинам человека, конъюгированные с пероксидазой хрена или другими ферментными маркерами.
МЕТОД ИММУНОБЛОТИНГА
Одним из современных методов диагностики сифилиса является иммуноблотинг (Western blot) для определения IgG либо IgM. При проведении иммуноблотинга T.pallidum подвергаются электрофорезу в градиенте концентрации додецилсульфата натрия, в результате чего происходит разделение белковых иммунодеерминант на нитроцеллюлозе. Затем производится обработка разделенных «точек» (blots) исследуемой сывороткой и антителами к IgG либо IgM, меченными ферментами либо радиоактивными веществами. IgG — иммуноблотинг по чувствительности и специфичности подобен РИФ-абс. Применение анти-IgM специфического конъюгата (IgM Western blot) при проведении иммуноблотинга может служить диагностическим тестом для врожденного сифилиса, более чувствительным по сравнению с FTA — ABS 19S IgM (чувствительность и специфичность 83 и 90% соответственно).
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)
Применяется для определения специфических последовательностей ДНК. Метод заключается в многократном увеличении (амплификации) количества ДНК диагностируемого микроорганизма. Разработка вариантов ПЦР для диагностики сифилиса обусловливается недостаточностью стандартных тестов при раннем серонегативном, врождённом сифилисе и нейросифилисе. Обнаружение T.pallidum с помощью ПЦР значительно облегчается выраженным генетическим консерватизмом и практическим отсутствием рекомбинаций даже между подвидами. Большим достоинством ПЦР является возможность автоматизации реакции путём заданного циклического температурного режима. Применение ПЦР может иметь большое значение при диагностике врождённого сифилиса (пассивный трансплацентарный перенос антител не влияет на результаты теста), нейросифилиса (чувствительность существующих тестов около 50%), первичного серонегативного (в настоящее время одним из критериев является прямое микроскопическое обнаружение трепонем), а также при диагностике сифилиса у ВИЧ-инфицированных.
ИССЛЕДОВАНИЕ СПИНОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ
Данные исследования спинномозговой жидкости (ликвора) используют в следующих случаях: — для определения поражения сифилисом нервной системы; — как критерий качества лечения у лиц с патологическими изменениями в ликворе до лечения; — как один из критериев излеченности больного. В клинической лаборатории исследуют цитоз, содержание белка, глобулиновые реакции Панди и Нонне-Апельта. В серологической лаборатории проводят реакцию Вассермана с тремя разведениями ликвора, реакцию Ланге с коллоидным золотом, РИТ, РИФю и РИФ„ (реакция иммунофлюоресценции с цельным ликвором). Минимальные патологические изменения в спинномозговой жидкости следующие: содержание белка, начиная с 0,4%; цитоз — 8 клеток в 1 мм3; глобулиновые реакции (реакция Нонне-Апельта ++, реакция Панди +++); реакция Ланге — больше двух двоек в цифровом значении; положительная реакция Вассермана. Показатели выше указанных, даже будучи изолированными, свидетельствуют о выраженных патологических изменениях в спинномозговой жидкости. Патологической считается также такая спинномозговая жидкость, в которой несколько показателей изменены соответственно данным минимальной патологии, а реакция Вассермана положительная. Для обозначения позитивности глобулиновых реакций и РВ применяется система четырех плюсов: резко положительный результат (4+), положительный (3+), слабоположительный (2+), сомнительный (1+). Использование РИФ также целесообразно при ликвородиагностике сифилиса. Особенно высокочувствителен и специфичен тест с цельным ликвором (РИФ-ц). РИТ со спинномозговой жидкостью по постановке, регистрации и оценке результатов аналогична таковой при исследовании сыворотки крови. Применение РИФ и РИТ расширяет возможности определения сифилитического поражения нервной системы.

Комментариев пока нет.

Добавить комментарий


About Беркегейм Михаил

Я родился 23 ноября 1945 года в Москве. Учился в школе 612. до 8 класса. Мама учитель химии. Папа инженер. Я очень увлекался химией и радиоэлектроникой. Из химии меня очень увлекала пиротехника. После взрыва нескольких помоек , я уже был на учете в детской комнате милиции. У меня была кличка Миша – химик. Из за этого после 8 класса дед отвел меня в 19 мед училище. Где меня не знали. Мой отчим был известный врач гинеколог. В 1968 году я поступил на вечерний факультет медицинского института. Мой отчим определил мою профессию. Но увлечение электроникой не прошло, и я получил вторую специальность по электронике. Когда я стал работать врачом гинекологом в медицинском центре «Брак и Семья» в 1980 году, я понял., что важнейшим моментом в лечении бесплодия является совмещение по времени секса и овуляции. Мне было известно, что овуляция может быть в любое время и несколько раз в месяц. И самое главное, что часто бывают все признаки овуляции. Но ее не происходит. Это называется псевдоовуляция. Меня посетила идея создать прибор надежно определяющий овуляцию. На это ушло около 20 лет. Две мои жены меня не поняли. Я мало времени уделял семье. Третья жена уже терпит 18 лет. В итоге прибор получился. Этот прибор помог вылечить бесплодие у очень многих женщин…
×
Записаться на приём или задать вопрос