Определение биоваров Уреаплазма уреалитикум

Аспекты лабораторной диагностики урогенитального микоплазмоза
М. И. Курдина  И. В. Колмогорова
Проанализирована диагностическая ценность различных методов лабораторной диагностики урогенитального микоплазмоза.
 

Актуальность проблемы урогенитального микоплазмоза обусловлена не столько значительным распространением этой инфекции в популяции, сколько неоднозначностью ее оценки как эпидемиологами, так и клиницистами. Статистически достоверных данных о распространенности микоплазм среди различных групп населения очень мало, и зачастую они достаточно противоречивы. Вместе с тем различные виды микоплазм могут являться причиной ряда заболеваний урогенитального тракта, этиологическим фактором преждевременных родов, невынашивания беременности, нарушения репродуктивной функции, случаев мертворождения. С другой стороны, отмечается возможность бессимптомного носительства микоплазм у клинически здоровых лиц. Отсутствие патогномоничных симптомов делает невозможным постановку диагноза без привлечения специальных лабораторных методов исследования. Широкое распространение этих микроорганизмов в популяции и высокая частота носительства и длительного бессимптомного течения процесса требуют создания единого алгоритма диагностики.В настоящее время предложено достаточно много методов и диагностических тест-систем для лабораторной диагностики микоплазменной инфекции. В настоящем обзоре представлен анализ рекомендованных методов лабораторной диагностики и освещены их диагностические возможности.Иммунологические методыСерологическая диагностика микоплазменной инфекции основывается на обнаружении специфических антител, которые можно выявить с помощью реакции пассивной гемагглютинации. Для выявления антигенов возбудителей используют реакции прямой (РИФ) и непрямой иммунофлюоресценции, реакцию агрегат-гемагглютинации [6, 9]. Существенным недостатком перечисленных тестов является тот факт, что гуморальные антитела к Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum могут присутствовать у клинически здоровых лиц, а инфицирование людей Ureaplasma urealyticum не всегда сопровождается повышением уровня антител, поэтому методы серологического выявления специфических антител эффективны лишь в определенных, как правило, острых случаях [6, 7, 9, 10]. Только выявление нарастания титра антител не менее чем в 4 раза может служить диагностически важным критерием [3]. В большинстве случаев серологические исследования не позволяют четко интерпретировать полученные результаты. Это объясняется высокой антигенной разнородностью возбудителя [13, 15]. К тому же у микоплазм, лишенных клеточной стенки, отсутствуют достаточно выраженные антигенные детерминанты, следствием чего является слабая стимуляция антителообразования, поэтому анализ серологических данных весьма затруднен. Этим объясняется довольно низкая (62-75%) диагностическая ценность вышеупомянутых тестов [3, 4].Обнаружена корреляция между уровнем IgA, IgM, IgG и выделением микоплазм у лиц с негонококковыми уретритами [4, 9, 12]. У женщин с послеродовыми осложнениями, вызванными микоплазмами, отмечалось четырехкратное нарастание титра антител, а у женщин со спонтанными абортами на 2-м месяце беременности наряду с выделением микоплазм наблюдались высокие титры антител [6, 9]. Аналогичные данные получены и при моделировании инфекции, вызванной Mycoplasma hominis, на животных [9].Однако при обследовании женщин, больных сальпингитом, микоплазменная этиология которого доказана бактериологически, лишь у 34% обследованных обнаружено увеличение уровня IgM [9]. При массовом обследовании женщин с сальпингитами и цервицитами у 50% пациенток была выделена Mycoplasma hominis, а четырехкратное нарастание титра антител отмечено лишь у 25% женщин [3].Весьма эффективным является также применение методов люминесцентной и иммунофлюоресцентной микроскопии. Первый из них может быть успешно применен для обнаружения уреаплазм, адсорбированных на сперматозоидах. Для метода РИФ используют специфическую антисыворотку, конъюгированную с флюорохромом. Этим методом можно выявить микоплазмы в мазке из влагалища, уретры или шейки матки, а также в секрете предстательной железы. РИФ относится к числу наиболее доступных методов и не требует специального оборудования, но не обладает достаточной диагностической ценностью вне зависимости от производителя диагностикумов. Для ряда тест-систем характерны относительно низкая воспроизводимость, случаи получения ложноположительных результатов за счет возникающих сложностей при дифференцировке истинного и ложного свечения в препаратах при люминесцентной микроскопии [8].ПЦР-диагностикаОсновными достоинствами полимеразной цепной реакции (ПЦР) являются ее высокая чувствительность и специфичность. Кроме того, в современном варианте эта реакция высокотехнологична, что позволяет проводить ее в автоматическом режиме с использованием лабораторных роботов [1, 2]. Указанные достоинства ПЦР привели к ее быстрому внедрению в повседневную диагностику таких заболеваний, как хламидиоз, герпетическая инфекция, гонорея, ВИЧ-инфекция и др. [6]. При диагностике заболеваний, вызываемых микоплазмами, ПЦР также нашла применение.Одной из основных биологических особенностей микоплазм является исключительно малый размер их генома [6, 9]. У микоплазм и уреаплазм он составляет всего 450-550 МД. Геном такого размера способен кодировать не более 500 полипептидов [14]. При таком размере генома выбор амплифицируемой последовательности приобретает особое значение.Специфичность ПЦР зависит, с одной стороны, от специфичности праймеров, с другой — от консервативности ампликона. Второе обстоятельство особенно важно при детекции амплифицированной последовательности методом электрофореза. Одной из характерных черт микоплазм является высокий уровень гетерогенности их генома. В геносистематике принято, что микроорганизмы одного вида должны иметь степень гомологии ДНК не ниже 70%. В то же время показано, что у Mollicutes степень гомологии ДНК внутри вида может варьировать от 100 до 48% [6]. Показано, что одним из наиболее консервативных участков генома микоплазм является последовательность, кодирующая 16S рРНК [6]. В этой связи было предложено использовать праймеры именно к данному участку генома. Другой мишенью, часто используемой при выявлении в пробе Ureaplasma urealyticum является ген уреазы, а для Mycoplasma hominis — ген аргининдезаминазы. Выбор праймеров с разной специфичностью позволяет использовать ПЦР не только для обнаружения микоплазм в пробе, но и для решения ряда других вопросов.В настоящее время Ureaplasma urealyticum по антигенным свойствам делится на 14 сероваров [6]. Молекулярно-биологические исследования позволили выделить внутри этого вида два генетически детерминированных биовара: T960, включающий серовары 2, 4, 5, 7-13 и parvo, объединяющий серовары 1, 3, 6 и 14 [14]. В.М. Безруков и соавт. использовали трехпраймерную систему, специфичную для гена 16S рРНК Ureaplasma urealyticum [2]. Один из праймеров был универсален, а два других специфичны для биоваров Т960 и parvo. При обнаружении в Ureaplasma urealyticum биовара T960 амплифицировалась последовательность 1278 пар нуклеотидов, а при обнаружении Ureaplasma urealyticum биовара parvo — последовательность 641 пары нуклеотидов. При использовании описанной системы для идентификации культур, выделенных от пациентов, было показано, что у женщин с клиникой вагинита чаще выделяются более вирулентные штаммы биовара parvo. Аналогичные исследования для прямого обнаружения уреаплазм в исследуемом материале были проведены рядом зарубежных авторов, которые показали б€ольшую значимость биовара parvo в развитии патологии беременности [16, 17].В последние годы накоплено много данных о механизмах развития антибиотикорезистентности у Mycoplasmataceae. Использование праймеров к tet(M) гену, обеспечивающему устойчивость Mycoplasma hominis к тетрациклину, позволяет выявлять эту детерминанту в клинических изолятах [9]. Применение специальных методов детекции амплифицированных последовательностей («конформационный полиморфизм одноцепочечных фрагментов ДНК — SSCP») позволяет выявлять даже точковые мутации. Так, использование этого метода позволяет выявлять мутацию гена gyrA Mycoplasma hominis, кодирующего синтез субъединицы А ДНК-гиразы. Эта мутация ответственна за развитие резистентности к препаратам фторхинолонового ряда [14, 16].Одним из недостатков ПЦР в классическом варианте постановки является ее качественный характер. Учитывая, что микоплазмы, обнаруживаемые в урогенитальном тракте, относятся к условно-патогенным микроорганизмам, этот недостаток не позволяет установить этиологическую значимость выявленного агента. В настоящее время предприняты попытки разработки количественного варианта ПЦР. Наиболее современные ПЦР-системы реального времени (Real-time PCR), основанные на использовании люминесцентных зондов, позволяют проводить количественные исследования [16]. Однако эти системы требуют использования специальных амплификаторов с встроенным лазерным спектрофотометром и не нашли широкого применения.Культуральный методРегрессивный характер эволюции микоплазм, сопровождавшийся редукцией генома до минимальных размеров, привел к множественной дефектности ферментных систем этих микроорганизмов, что осложняет их культивирование. В течение длительного времени считалось, что ряд видов, например, Mycoplasma genitalium (M.g.), способны к размножению только в культуре клеток. В настоящее время показано, что все известные виды микоплазм можно культивировать на искусственных питательных средах.Их основу составляют высококачественные пептоны и перевары (например, ферментативный перевар из бычьих сердец, триптикаво-соевый бульон). Помимо высококачественной белковой основы, среды для микоплазм должны содержать ряд добавок, играющих роль факторов роста. Одним из важнейших компонентов мембран являются стеролы (холестерин) и жирные кислоты. Поскольку микоплазмы не способны к синтезу стеролов, холестерин добавляют в среду в готовом виде. Как правило, в качестве источника холестерина используют лошадиную сыворотку, которая содержит его в высокой концентрации.Обычно и плотные, и жидкие среды для первичного выделения Mycoplasmataceae обладают дифференцирующими свойствами. По способности гидролизировать аргинин и сбраживать моносахариды, в частности глюкозу, микоплазмы делят на ферментирующие и неферментирующие виды. Рост на питательных средах микоплазм, ферментирующих глюкозу, сопровождается накоплением в среде молочной кислоты и сдвигом рН в кислую среду [6, 9]. Ферментация аргинина, напротив, ведет к накоплению щелочных продуктов метаболизма [5, 6]. Важно отметить, что, как правило, виды, ферментирующие глюкозу, инертны по отношению к аргинину и наоборот. Это обстоятельство открывает возможность использования аргинина и глюкозы в качестве дифференцирующих факторов в составе единой дифференцирующей среды.Для идентификации уреаплазм ключевым признаком является образование аммиака из мочевины [5, 6, 9]. Образующийся аммиак сдвигает рН среды в щелочную сторону, что легко может быть выявлено с помощью индикатора. В плотные питательные среды в качестве дифференцирующего субстрата включают сульфат марганца. Рост на этих средах Ureaplasma urealyticum сопровождается образованием оксида марганца, окрашивающего колонии этих микроорганизмов в коричневый цвет, в то время как колонии микоплазм остаются бесцветными [9].Представители семейства Mycoplasmataceae высокочувствительны к воздействию факторов внешней среды [6, 9]. В связи с этим транспортировка патологического материала в лабораторию должна осуществляться максимально быстро. Специальные транспортные средства для этой группы микроорганизмов не разработаны. Обычно доставку проб осуществляют в жидкой питательной среде. Далее в зависимости от схемы исследования делают высев на плотную или жидкую среду из транспортного бульона или его разведений. В некоторых коммерческих диагностических системах, например, Mycoplasma IST, Mycoplasma DYO (фирма «BioMerieux», Франция), для транспортировки используют основу уреааргининового бульона (R1). При этом сроки транспортировки могут составлять 4-5 ч при комнатной температуре и увеличиваться до 2 сут при условии хранения пробы при 4 °С [11]. После доставки в лабораторию бульон переносится во флакон с лиофильно высушенными селективными и дифференцирующими добавками и инкубируется. При исследовании жидких проб (моча, эякулят) материал доставляют в лабораторию без транспортной среды и подвергают дальнейшему исследованию осадок, получаемый при центрифугировании [11].Температурный оптимум роста представителей семейства Mycoplasmataceae 36-37°С, однако рост регистрируется в достаточно широком температурном диапазоне — от 22 до 41°С. Большинство микоплазм — факультативные анаэробы, но из-за укороченности электронно-транспортных цепей, оканчивающихся флавиновыми ферментами, в питательных средах накапливается большое количество токсичных для клеток перекисных соединений. Поэтому данные микроорганизмы лучше растут в анаэробных или микроаэрофильных условиях. Продолжительность инкубации посевов при диагностике заболеваний, вызываемых микоплазмами, может достигать 12 дней. Она во многом зависит от состава и типа используемой среды, а также вида выделяемых микоплазм. Так, Mycoplasma Agar (Mycoplasma Agar Base + Mycoplasma Supplement-P, Code CM401+SR60, Oxoid, Великобритания) необходимо инкубировать в течение 7 дней, а модифицированную среду А7 (фирма «BioMerieux», Франция) — 24-48 ч [11]. Жидкие среды инкубируются в течение 18-24 ч для обнаружения Ureaplasma urealyticum или 48-72 ч — для обнаружения Mycoplasma hominis или M. fermentans [9]. Рост микоплазм на жидких питательных средах не сопровождается их помутнением. Это связано с тем, что даже в самых благоприятных условиях концентрация микроорганизмов не превышает 106 — 107 в 1 мл. При такой концентрации может отмечаться лишь слабая опалесценция среды. Интенсивное помутнение свидетельствует о размножении контаминантов. Использование ингибитора роста в специальных лунках на стрипе позволяет проводить количественную оценку патологической концентрации (≥104) M. hominis и U. urealyticum.Традиционное выделение чистой культуры микоплазм, как правило, не осуществляют. Это, как уже было сказано выше, связано с особенностями данных микроорганизмов. Образование характерных колоний на плотной среде или выявление ферментации аргинина, глюкозы или мочевины в жидких средах позволяет уже в первичном посеве производить идентификацию микоплазм с точностью, вполне достаточной для практических нужд.Определение чувствительности к антибиотикамДля определения чувствительности выделенной культуры к антибиотикам используют метод разведений в жидкой среде. При этом, как правило, берутся пограничные для данного антибиотика концентрации. Пробирки с агрининовым бульоном (для Mycoplasma hominis) или бульоном с мочевиной (для Ureaplasma urealyticum), содержащие 2-3 концентрации выбранного антибиотика, засевают испытуемой культурой. Отсутствие роста свидетельствует о чувствительности микроорганизма к данному препарату, появление роста в пробирке с меньшей концентрацией антибиотика свидетельствует об умеренной устойчивости культуры. А рост во всех пробирках — о ее устойчивости [9]. Основным недостатком такого метода определения антибиотикорезистентности является его высокая трудоемкость при очень низкой стандартности исследования. Указанный недостаток может быть устранен при использовании коммерческих тест-систем для определения чувствительности микоплазм к антибиотикам. Так, тест-система Mycoplasma IST (фирма «BioMerieux», Франция) позволяет определить чувствительность к 6 препаратам — тетрациклину, доксициклину, эритромицину, джозамицину, офлоксацину по двум контрольным точкам и к пристинамицину — по одной точке. Тест-система S.I.R. Mycoplasma (фирма «Diagnostics Pasteur», Франция) предназначена для определения чувствительности к 8 антибиотикам — доксициклину, миноциклину, лимециклину, джозамицину, эритромицину, клиндамицину, пристинамицину и офлоксацину. В первой из названных систем процессы первичного выделения и определения антибиотикорезистентности совмещены, что приводит к неоправданным затратам в случае отрицательного исследования, однако такая стратегия позволяет при положительном результате выдать окончательный ответ на 1-2 сут раньше, чем при использовании второй тест-системы.Проведенный анализ позволяет заключить, что комплекс используемых лабораторных методов достаточно эффективен для диагностики урогенитальных микоплазмозов. Вместе с тем в каждом случае целесообразен дифференцированный подход. ПЦР-диагностика является оптимальной методикой для оперативного и ретроспективного анализа распространенности данной инфекции на отдельных территориях. В случаях же упорно рецидивирующей инфекции, плохо поддающейся лечению обычно используемыми препаратами, либо в случаях смешанной инфекции обследование следует проводить культуральным количественным методом с определением чувствительности выделенных штаммов.Литература1. Бурова А.А., Маликов В.Е., Минаев В.И. Клин лаб диагн 1997; 6:62.2. Безруков В.М., Назаренко Е.Г., Доронина Е.П. и др. Клиническое значение определения биоваров Ureaplasma urealyticum с использованием ПЦР-диагностики. Всероссийская научно-практическая конференция «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний», 2-я: Материалы. М 1998;31-35.3. Вульфович Ю.В. и др. Лабораторная диагностика микоплазмоза и уреаплазмоза у урологических и гинекологических больных. Журн микробиол 1995;5:97-100.4. Гладкова Н.С., Киселев В.И., Дарижатова Б.Д. и др. Оценка различных методов лабораторной диагностики урогенитальных микоплазм. Вестн дерматол 1999;2:43-45.5. Гамова Н.А. Ureaplasma urealyticum и ее роль в патогенезе урогенитальной инфекции: Автореф. ……… дис. …канд. мед. наук. М 1993;23.6. Козлова В.И., Пухнер А.Ф. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий: Руководство для врачей. М 1997;426-438.7. Кубанова А.А., Юцковская Я.А., Юцковский А.Д. Клинико-эпидемиологические аспекты уреаплазменной инфекции урогенитального тракта у жителей Приморского края. Вестн дерматол 2001;6:43-46.8. Маликов В.Е. и др. Информативность методов лабораторной диагностики инфекций урогенитального тракта микоплазменной этиологии. Кремлевская медицина 2000;1:53-55.9. Прозоровский С.В., Раковская И.В., Вульфович Ю.В. Медицинская микоплазмология. М: Медицина 1995;288.10. Прозоровский С.В., Вульфович Ю.В., Раковская И.В. Микоплазмы и микоплазменные инфекции человека. Клин мед 1992;9-10:14-19.11. Biomerieux Culture Media Manual. 1994; 100.12. Brown M.B., Cassell G.H., Taylor-Robinson D. et al. Measurement of antibody to Ureaplasma urealyticum by an enzymelinked immunosorbent assay and detection of antibody responses in patients with nongonococcal urethritis. J Clin Microbiol 1983;22:288-295.13. Krause D.C., Taylor-Robinson D. Mycoplasmas which infect humans. In: Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. Eds. J. Maniloff, R.N. McElhaney, L.R. Finch, J.D. Baseman. Washington: American Society for Microbiology 1992;417-444.14. Povlsen K., Jensen J.S., Lind I. Detection of Ureaplasma urealyticum by PCR and Biovar Determination by Liquid Hybridization. J Clin Microbiol 1998;36:11:3211-3216.15. Tryon V.V., Baseman J.B. Pathogenic determinants and mechanism. In: Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. Eds. J. Maniloff, R.N. McElhaney, L.R. Finch, J.B. Baseman. Washington (DC): American Society for Microbiology 1992;457-471.16. Taylor-Robinson D., Thomas B.J., Furr P.M. et al. Sex Trans Dis 1983;10:341-344.17. Duffy L.B., Crabb D., Searcey K., Kempf M.C. Comparative potency of gemifloxacin, new quinolones, macrolides, tetracycline and clindamycin against Mycoplasma spp. J Antimicrob Chemother 2000; 45:Suppl 1:29-33.Поступила 26.04.04

Комментариев пока нет.

Добавить комментарий


About Беркегейм Михаил

Я родился 23 ноября 1945 года в Москве. Учился в школе 612. до 8 класса. Мама учитель химии. Папа инженер. Я очень увлекался химией и радиоэлектроникой. Из химии меня очень увлекала пиротехника. После взрыва нескольких помоек , я уже был на учете в детской комнате милиции. У меня была кличка Миша – химик. Из за этого после 8 класса дед отвел меня в 19 мед училище. Где меня не знали. Мой отчим был известный врач гинеколог. В 1968 году я поступил на вечерний факультет медицинского института. Мой отчим определил мою профессию. Но увлечение электроникой не прошло, и я получил вторую специальность по электронике. Когда я стал работать врачом гинекологом в медицинском центре «Брак и Семья» в 1980 году, я понял., что важнейшим моментом в лечении бесплодия является совмещение по времени секса и овуляции. Мне было известно, что овуляция может быть в любое время и несколько раз в месяц. И самое главное, что часто бывают все признаки овуляции. Но ее не происходит. Это называется псевдоовуляция. Меня посетила идея создать прибор надежно определяющий овуляцию. На это ушло около 20 лет. Две мои жены меня не поняли. Я мало времени уделял семье. Третья жена уже терпит 18 лет. В итоге прибор получился. Этот прибор помог вылечить бесплодие у очень многих женщин…