ДНК Mycoplasma hominis

Гарднереллез не относится к венерическим болезням и обусловлен дисбалансом микрофлоры влагалища. В норме она представлена преимущественно лактобациллами. Эти бактерии образуют молочную кислоту и перекись водорода, препятствуя размножению условно-патогенных микроорганизмов. В состав нормальной микрофлоры влагалища в небольшом количестве могут входить Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis и анаэробные бактерии (рода Mobiluncus и другие). Эти микроорганизмы в небольшом количестве присутствуют во влагалище большинства здоровых женщин.
При нарушениях микробиоценоза влагалища, гарднереллы вызывают у женщин бактериальные вагиниты (воспаление слизистой оболочки влагалища). Гарднереллез может являться причиной осложнений беременности: воспалительных заболеваний, маточных кровотечений, послеродового эндометрита, пневмонии у новорожденных. Носительство гарднерелл у здоровых мужчин наблюдается редко. В мочеполовых путях мужчин бактерии долго не сохраняются, что объясняют действием неблагоприятных факторов, препятствующих колонизации.
Факторами риска для развития гарднереллеза являются: антибиотикотерапия, спринцевание, применение противозачаточных средств, содержащих 9-ноноксинол (свечи «Патентекс Овал», свечи «Ноноксинол»). Кроме того, предрасполагающими факторами служат сахарный диабет, беременность, менопауза, эндокринные нарушения, приводящие к дисбалансу эстрогена и прогестерона в организм е. Все это приводит к изменению pH и концентрации сахара на слизистой влагалища, в результате чего гарднереллы в ассоциации с анаэробами, такими как бактероиды, пептострептококки и мобилункусы, вызывают вагинит. Поскольку в ассоциации с гарднереллами выделяются самые разные виды неспорообразующих анаэробов, то эти вагиниты получили название неспецифических. В запущенных состояниях возможны поражения внутренних половых и мочевых путей.
Восприимчивость к гарднереллам, как ко всем условно-патогенным микробам, низкая у лиц с нормальным иммунным статусом и повышенная у людей с ослабленным иммунитетом. Распространен гарднереллез повсеместно, чаще болеют женщины репродуктивного возраста.
Показания к назначению анализа на наличие Gardnerella vaginalis:
Обильные однородные кремообразные влагалищные выделения серовато-белого цвета, прилипающие к стенкам влагалища;
Выделения неприятного (рыбного) запаха, который возникает в результате распада аминов, вырабатываемых анаэробными бактериями;
Воспалительный процесс во влагалище;
Вульвовагинальное раздражение в виде зуда и жжения, а также неприятные ощущения при половом акте;
Нарушение микробиоценоза кишечника;
Предшествующая антибактериальная терапия;
 
ДИАГНОСТИКА ГАРДНЕРЕЛЛЕЗА
 
(по материалам НИИ физико-химической медицины МЗ РФ Научно-производственная фирма «ЛИТЕХ» Московский Государственный университет им.М.В.Ломоносова Российская медицинская академия последипломного образованияЛ.В. Кудрявцева, Е.Н.Ильина, В.М. Говорун, В.И.Минаев, С.В.Зайцева, Е.В.Липова, Э.А.Баткаев)
Молекулярно-биологические методы идентификации нуклеиновых кислот микроорганизмов находят все более широкое применение в практической медицине. Одним из основных приложений молекулярно-биологических подходов для решения медицинских задач остается изучение бактериальной микрофлоры, населяющей организм человека в норме и патологии. Причины этого кроются в самом характере микрофлоры, проводить лабораторную диагностику которой необходимо при нарушении микробиозинозов (дисбактериоз влагалища, желудочно-кишечного тракта и т.д.). При данных патологиях классическими лабораторными методами обследования являются культуральный посев и микроскопия.
Золотым стандартом микробиологии считается культуральный посев — исследование, обладающее 100% специфичностью по отношению к данному возбудителю. Основным методическим приемом микробиологии является выделение и культивирование бактериальной флоры в виде чистой культуры. Этот этап накладывает существенные ограничения на возможности использования микробиологического анализа для полной оценки состояния микрофлоры. По различным данным мы способны культивировать не более 15% микроорганизмов, населяющих организм человека. Некультивируемые микроорганизмы могут быть представлены известными или неизвестными видами, неспособными расти в лабораторных условиях или находящимися в «дремлющем» состоянии (споры). Проблема культуральной диагностики БВ в том, что высеваемая микрофлора представлена анаэробными (облигатными и факультативными) микроорганизмами и микроаэрофилами. Если культивирование факультативных анаэробов не представляет особой сложности, то бактериологическое обнаружение строгих анаэробов и микроаэрофилов затруднено. Для проведения адекватного бактериологического исследования на анаэробы и микроаэрофилы необходимо наличие специальных сред, как транспортных, так и сред для культивирования, а также создание определенных условий инкубации. Несмотря на достигнутые успехи в области создания культуральных сред для обнаружения Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum и Mobiluncus spp., их культивирование и идентификация остаются деликатной процедурой, требующей длительного времени и опыта. Соблюдение всех этих требований часто оказывается невозможным для рядовой бактериологической лаборатории, но даже в хорошо оснащенных клинико-диагностических центрах процент высеваемости этих микроорганизмов составляет 12-60 %.
Существенным недостатком культурального посева является
Читать дальше

также длительность исследования. Время роста отдельных микроорганизмов может составлять от нескольких дней до нескольких недель, в течение которых больной не получает адекватного лечения. В ряде случаев при БВ необходима видовая идентификация возбудителя (например, для представителей рода Mobiluncus, Fusobacteria), что требует дополнительных средств и времени при использовании микробиологического подхода.
Отчасти проблему обнаружения анаэробной микрофлоры в лабораторных условиях решает использование световой микроскопии с окраской мазка по Грамму. При таком обследовании легко обнаружить микроорганизмы, имеющие характерную форму и локализацию. Как сказано выше, одним из критериев БВ яляется наличие «ключевых» клеток, которые можно увидеть в урогенитальном мазке под микроскопом. Это зрелая эпителиальная клетка, по всей поверхности которой плотно и в большом количестве прикреплены мелкие граммвариабельные палочки, представляющие собой G. vaginalis. (рис.2-3)
Рис. 2-3 Gardnerella vaginalis на поверхности эпителиальных клетокисточник: Материал из Википедии — свободной энциклопедии, http://www.gineco.com.br/gardnere.htm

Одновременно в таком мазке можно обнаружить представителей семейства Mobiluncus, имеющих характерную форму. При окраске по Граму они вариабельны или граммотрицательны, несмотря на строение клеточной стенки, характерной для граммположительных бактерий. Это связано с очень тонким пептидогликановым слоем, что снижает эффективность прокрашивания.
Существенным недостатком микроскопического анализа мазка является невозможность видовой идентификации микроорганизмов. Качественная оценка микрофлоры заключается в характеристики только морфотипов бактерий: лактоморфотип, морфотипы гарднереллы, бактероидов, фузобактерий, мобилункуса, вейллонеллы, что является очень грубой оценкой состояния бактериальной микрофлоры.
Решить проблему быстрого и качественного обнаружения представителей анаэробной микрофлоры и микроэророфилов способны методы генодиагностики (ДНК-ДНК гибридизация и ПЦР), позволяющие выявлять микроорганизмы непосредственно в урогенитальном мазке, минуя стадию культивирования и выделения чистой культуры. Методы генодиагностики основаны на детекции ДНК возбудителя в клиническом материале. Сходство физико-химических свойств всех нуклеиновых кислот позволило создать универсальные процедуры обнаружения ДНК любых микроорганизмов в биопробе, а уникальность генетического материала каждого конкретного возбудителя легла в основу специфичности метода, позволяющего проводить видовую идентификацию. Для проведения генодиагностики не требуется забор образцов в специальные транспортные среды и создания особых условий хранения и транспортировки, что существенно снижает себестоимость проводимого анализа. При этом время проведения анализа сопоставимо по скорости с микроскопическим исследованием и составляет 4,5-5 часов.
Основным методом генодиагностики, используемым при обследовании больных с БВ, является полимеразная цепная реакция — ПЦР и ее модификации.
В основе метода ПЦР лежит комплиментарное достраивание участка геномной ДНК или РНК возбудителя, осуществляемое in vitrо с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы. Специфичность метода определяется уникальностью генетического материала выявляемых инфекционных агентов, к которому подобраны олигонуклеотидные праймеры, участвующие в процессе амплификации.
ПЦР-анализ клинического образца включает в себя три основных этапа: пробоподготовка, амплификация и регистрация результатов. Забор клинических образцов для проведения ПЦР диагностики не требует специальных транспортных сред. Объектом исследования может служить любой биоматериал (соскоб клеток цервикального канала, уретры, отделяемое содержимое влагалища) взятый от больного и на холоду доставленный в ПЦР лабораторию. В результате несложных манипуляций из полученного биоматериала выделяют нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), являющиеся матрицей в реакции амплификации. Реакция амплификации представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 30-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой специфических праймеров, в количестве, достаточным для его детекции. Детекция продуктов амплификации осуществляется с помощью электрофореза в агарозном геле (большинство отечественных тест-систем) либо путем гибридизации со специфическим к последовательности ампликона олигонуклеотидным зондом (диагностические системы фирмы Roche, наборы серии ПлаТАн НПФ «Литех»).
Отличительной особенностью ПЦР диагностики является универсальность подхода для выявления различных инфекционных агентов. Так как объектом исследования служит молекула ДНК, обладающая сходными химическими свойствами у всех организмов, процедуры выявления вирусной, бактериальной, человеческой ДНК одинаковы, что позволяет проводить комплексное исследование биопробы методом ПЦР.
Наряду с культуральным методом и микроскопией, ПЦР является прямым методом выявления возбудителя, но при этом обладает существенно большей чувствительностью. Чувствительность ПЦР достигает единичных копий возбудителя в биопробе, что позволяет существенно повысить эффективность выявления инфекционных агентов непосредственно в клиническом образце, минуя стадию бактериологического посева. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики представители микрофлоры с внутриклеточной или мембранной локализацией (Chlamydia trachomatis, представителей семейства Mycoplasma и др.), а также трудно-культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.
Применение метода ПЦР диагностики позволяет избежать сложностей идентификации микроорганизмов, имеющих малые физические размеры и разнообразные формы, так как снимаются ограничения на размер и формы возбудителя, накладываемые использованием световой микроскопии с окраской мазка по Грамму.
Особенностью протекания микоплазменных инфекций является стертый имунный ответ организма хозяина и высокая антигенная изменчивость самого возбудителя, что делает неэффективным использование методов ИФА и выводит на первый план ПЦР-диагностику.
В урогинекологической практике наиболее рационально и экономически обоснованно использование метода ПЦР для выявления Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae [32], представителей семейства Mycoplasma [41, 42], Gardnerella vaginalis [66, 86] и вирусных инфекций (урогенитального герпеса и цитомегаловируса) [78]. В последнее время ПЦР активно используется для выявления представителей анаэробной флоры — Вacteroides spp, Mobiluncus curtissi, Fusobacterium nucleatum.
Исследование больной с БВ методом ПЦР позволяет в первую очередь исключить наличие безусловно патогенной микрофлоры (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae и Trichmonas vaginalis), требующей назначения адекватного этиотропного лечения.
Первые стандартизированные тест-системы AMPLICOR Chlamydia trachomatis (фирма «Roche») были внедрены в клиническую практику в 1992 году, а в 1993 начато их массовое производство. Позднее, в 1995 году появился новый набор AMPLICOR Chlamydia trachomatis / Neisseria gonorrhoeae (фирма «Roche»), позволяющий одновременно выявлять эти возбудители. По данным зарубежных и отечественных исследователей Chlamydia trachomatis обнаружена у 5 — 16 % больных, обследованных по поводу БВ [32].
Применение ПЦР технологии для детекции Trichmonas vaginalis позволяет в ряде случаев повысить специфичность анализа и существенно сократить время его производства. В ходе клинической апробации тест-системы для обнаружения ДНК Trichmonas vaginalis в вагинальных выделениях, предложенной Лин П.Н. с соавт. (1997 г), были получены данные по сравнению эффективности ПЦР диагностики, микроскопии и культурального посева. Из 165 клинических образцов 16 были положительны по данным ПЦР и росту культуры и только 9 из них были выявлены с помощью микроскопии [59]. В настоящее время тест-системы для обнаружения ДНК Trichmonas vaginalis (в том числе и отечественные) активно используются в практике клинико-диагностических лабораторий.
Широкое использование ПЦР диагностики Trichmonas vaginalis в практической медицине вскрыло другую проблему — высокий процент ложноположительных результатов по данным микроскопии мазка. По данным медицинского диагностического центра «Медикур» (Москва) в течение 4-х лет проводившего массовые обследования пациентов только у 0,7% больных выявляется Trichmonas vaginalis методом ПЦР и культуральным методом, тогда как по данным микроскопии встречаемость в 2,5 раза выше.
По данным клинико-диагностической лаборатории НПФ «Литех» среди больных, обследуемых по поводу БВ, процент выявляемости Chlamydia trachomatis составляет 5,7 %, Trichmonas vaginalis — 1,1%.
Обнаружение представителей безусловно патогеной микрофлоры на фоне БВ ведет к установлению пациенту соответствующего диагноза — хламидиоз, трихомониаз или гонорея.
Чаще всего ПЦР-диагностика позволяет выявить у больных с выраженным БВ представителей условно-патогенной микрофлоры Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum и Gardnerella vaginalis. По данным зарубежных исследователей Gardnerella vaginalis выявляется почти у всех обследованных пациенток с выраженным БВ (10 из 11) и у 40% женщин вне зависимости от их клинического статуса [66].
При выявлении условно-патогенных представителей семейства микоплазм использование ПЦР позволяет повысить эффективность и специфичность проводимых анализов. Так, при обследовании 50 больных с урогенительными патологиями у 12 -ти (24%) Ureaplasma urealyticum обнаружена методом ПЦР и только у 5 (10%) путем культивирования [84]. Методы генодиангостики позволяют не только обнаружить присутствие Ureaplasma urealyticum в клиническом образце, но и оценить степень патогенности возбудителя. Показано, что популяция Ureaplasma urealyticum — это гетерогенная группа микроорганизмов. Описано 14 серотипов Ureaplasma urealyticum, которые с помощью молекулярно-биологических подходов объединены в два биовара: Parvo и T-960. Предполагается, что биовар Parvo является более патогенным, чем биовар Т-960, и именно ему принадлежит ведущая роль в развитии уреаплазменной инфекции [72]. Проведение ПЦР анализа клинических образцов позволяет установить принадлежность выявляемой Ureaplasma urealyticum к одному из биоваров и таким образом оценить степень ее патогенности. По данным НПФ «Литех» у 83% обследованных больных с уреаплазменной инфекцией выявляется Ureaplasma urealyticum, принадлежащая к биовару Parvo и у 17% к биовару Т-960 [5].
В лабораторной практике широко используется метод ПЦР для выявления в клинических образцах ДНК Mycoplasma hominis, что позволяет отказаться от трудоемкого и дорогостоящего культурального метода. В последнее время помимо Mycoplasma hominis, при БВ диагностируется M. genetalium (1,5 %) [71] и M. fermentas [83], хотя их роль в развитии патологического процесса обсуждается.
На сегодняшний день в НПФ «Литех» проведены клинические испытания новых диагностических тест-систем, позволяющих выявлять методом ПЦР представителей анаэробной флоры — Mobiluncus curtissi, Prevotella (bacteroideа) bivia — в клиническом материале. Среди проанализированных образцов ДНК Mobiluncus curtissi выявлена в 12% случаев, ДНК Prevotella bivia — в 28%. Эти данные не противоречат общепринятым представлениям о высеваемости Mobiluncus curtissi и Prevotella bivia при БВ — 8-35% и до 80% соответственно.
В научном плане ПЦР используется для установления устойчивости к тетрациклину и эритромицину высеваемой при БВ анаэробной флоры — Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas [25, 74], Mycoplasma hominis [23]. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения патогенеза хронических инфекционных заболеваний.
Отдельно рассмотрим место ПЦР диагностики при обследовании больного с БВ. Метод ПЦР ни в коем случае не заменяет, а дополняет спектр традиционных методов (культуральный посев, микроскопия), используемых в диагностике БВ. Решающее значение он может иметь для диагностики представителей анаэробной микрофлоры, микроаэрофилов, внутриклеточных паразитов и вирусов. В некоторых случаях возможно совмещение метода ПЦР с культуральным посевом, что позволяет сократить суммарное время анализа и повысить его чувствительность. Но только совокупность всех доступных методов лабораторной диагностики позволяет провести всестороннее обследование пациентов для выявления этиотропного агента наблюдаемого дисбиоза, и как следствие, назначить адекватное лечение. Идея комплексной диагностики БВ воплощена в НПФ «Литех» путем слияния данных микроскопии мазка и ПЦР анализа для выявления анаэробной флоры — маркеров бактериального вагиноза.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ КОМПЛЕКСНОЙ ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИАЛЬНОГО ВАГИНОЗА

Результат ПЦР-исследования

Результат микроскопического исследования

Заключение

Рекомендация

Lactobacillus spp………………(+) Gardnerella vaginalis.(-) или (+)Mycoplasma hominis..(-) или (+)Ureaplasma ur.     …(-) или (+) Mobiluncus curtisii…..(-) или (+) Bacteroides spp………………..(-)

наличие единичных лейкоцитов и единичных «чистых» эпителиальных клеток соответственно фазе МЦ; Доминирование лактобактерий, отсутствие грамотрицательной микрофлоры, спор, мицелия, псевдогифов

НОРМОЦЕНОЗ

норма

Lactobacillus spp………………(-) Gardnerella vaginalis………….(-) Mycoplasma hominis………….(-) Ureaplasma urealyticum……..(-) Mobiluncus curtisii……………..(-) Bacteroides spp………………..(-)

Лейкоциты — в небольшом количестве; Полное отсутствие в исследуемом материале микрофлоры при неизменных эпителиоцитах

КОМПЕНСИРОВАННЫЙ БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ

Наблюдение, Повторное исследование через 1-2 месяца

Lactobacillus spp……………..(-) Gardnerella vaginalis…(-), оч редко(+)Mycoplasmahominis……чаще(+) Ureaplasma realyticum. чаще(+)Mobiluncus curtisii…..(+) или (-) Bacteroides spp……..(+) или (-)

«ключевые» клетки единичные в поле зрения; умеренный лейкоцитоз (15-25 лейкоцитов в поле зрения); возрастание количества сопутствующей грамвариабельной полиморфной бактериальной флоры

СУБКОМПЕНСИРОВАННЫЙ БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ

Заместительная терапия (местное лечение лактобактерином)

Lactobacillus spp…………….(-) Gardnerella vaginalis……..  (+) Mycoplasma hominis……….(+) Ureaplasma urealyticum……(+) Mobiluncus curtisii…………..(+) Bacteroides spp……………..(+)

«ключевые» клетки в большом количестве; лейкоциты в умеренном количестве; присутствие бактериальной флоры в виде монокультуры или в различных морфо- и видовыхсочетаниях

ДЕКОМПЕНСИРОВАННЫЙ БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ

Этиотропное лечение (антибактериальная терапия, направленная в основном против анаэробной флоры)

Lactobacillus spp…………….(-) Gardnerella vaginalis……….(-) Mycoplasma hominis………..(-) Ureaplasma urealyticum……(-) Mobiluncus curtisii……………(-) Bacteroides spp………………(-)

Большое количество лейкоцитов, макрофагов, эпителиальных клеток, выраженный фагоцитоз, морфологический пейзаж воспалительного процесса на фоне полного отсутствия лактобактерий и отсутствии явно выраженного этиотропного возбудителя

НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ВАГИНИТ

Проведение дополнительного микробиологического исследования на наличие возбудителя (посев с выделением чистой культуры с определением чувствительности к антибиотикам)

При обнаружении специфического этиотропного агента: гонококков, трихомонад, мицелия, псевдогифор, сопр — выставляется соответствующий этиологический диагноз (гонорея, трихомониаз, микотический вагинит и др.)

СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ВАГИНИТ

Этиотропное лечение

Комментариев пока нет.

Добавить комментарий


Беркегейм Михаил

About Беркегейм Михаил

Я родился 23 ноября 1945 года в Москве. Учился в школе 612. до 8 класса. Мама учитель химии. Папа инженер. Я очень увлекался химией и радиоэлектроникой. Из химии меня очень увлекала пиротехника. После взрыва нескольких помоек , я уже был на учете в детской комнате милиции. У меня была кличка Миша – химик. Из за этого после 8 класса дед отвел меня в 19 мед училище. Где меня не знали. Мой отчим был известный врач гинеколог. В 1968 году я поступил на вечерний факультет медицинского института. Мой отчим определил мою профессию. Но увлечение электроникой не прошло, и я получил вторую специальность по электронике. Когда я стал работать врачом гинекологом в медицинском центре «Брак и Семья» в 1980 году, я понял., что важнейшим моментом в лечении бесплодия является совмещение по времени секса и овуляции. Мне было известно, что овуляция может быть в любое время и несколько раз в месяц. И самое главное, что часто бывают все признаки овуляции. Но ее не происходит. Это называется псевдоовуляция. Меня посетила идея создать прибор надежно определяющий овуляцию. На это ушло около 20 лет. Две мои жены меня не поняли. Я мало времени уделял семье. Третья жена уже терпит 18 лет. В итоге прибор получился. Этот прибор помог вылечить бесплодие у очень многих женщин…
×
Записаться на приём или задать вопрос