ДИАГНОСТИКА ВОЛЧАНОЧНОГО АНТИКОАГУЛЯНТА. МЕЖДУНАРОДНЫЙ ВНЕШНИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
А.Л. Берковский, Е.В.Сергеева, А.В.Суворов, И.С.Ульянова, Н.Д.Качалова, А.А.Козлов.
УДК 615.273.53; 612.08; 612.117.5.
Гематологический научный центр РАМН, Москва
Волчаночный антикоагулянт (ВА) является компонентном антифосфолипидных антител, обуславливающих как подавление свертывания крови, так и “антифосфолипидный синдром”, клиническое проявление которого в основном заключается в развитии артериальных и венозных тромбозов. ВА относится к антителам, специфичным для фосфолипидов, фосфолипид-связывающих белков и комплексов фосфолипидов с данными белками. Наличие ВА может вызывать и ингибирование развитие тромботических состояний, что связано с его воздействием на гетерогенные антигенные мишени в системе гемостаза. Так, ВА связывается с фосфолипидами только в присутствие таких кофакторных белков как протромбин, протеин С, аннексин, что непосредственно изменяет состояние системы гемостаза. Известна связь ВА с активацией сосудистого эндотелия и тромбоцитов, воспалительными процессами сосудистой стенки. Кроме антикоагулянтного действия ВА может увеличивать образование тромбина, клеточную экспрессию тканевого фактора и его активность (подавление ингибитора пути тканевого фактора), изменять активность фибринолитической системы, системы протеина С и антитромбинов. ВА часто обуславливает различные патологии беременности [3, 9, 10, 11,12, 15, 16, 17].
Наличие, так называемого “парадокса ВА” (пролонгирование в тестах свертывания крови несмотря на проявления клинической тромбофилии, неспособность в ряде случаев определять наличие ВА в плазме больных с повышенной активностью факторов внутреннего пути свертывания крови [1] свидетельствуют о необходимости адекватного проведения диагностики ВА.
Тесты для выявления ВА проводят, используя реагенты, содержащие низкую концентрацию фосфолипидов, для усиления различия между нормальной и патологической плазмами, и реагенты с высокой концентрацией фосфолипидов или тромбоцитарных мембран для истощения антикоагулянтного эффекта ВА. Подкомитет по Волчаночному Антикоагулянту Комитета по Науке и Стандартизации Международного Общества по Тромбозам и Гемостазу предложил определенные критерии для диагностики ВА. Они включают:
• удлинение одного или более фосфолипид-зависимых скрининговых коагуляционных тестов;
• отсутствие коррекции удлинения теста при смешивании исследуемого образца с нормальной плазмой;
• коррекция удлинения теста при избытке фосфолипидов и
• отсутствие специфических ингибиторов любых факторов свертывающей системы крови.
Строгое соблюдение этих критериев, а также проведения не менее трех скриннинговых и подтверждающих тестов обеспечивает надежную лабораторную диагностику ВА. Применение двух различных скрининговых тестов обеспечивает процент выявления ВА 80 – 85%. При добавлении к тестпанели третьего метода процент выявления повышается вплоть до 100%. Чувствительность фосфолипид-содержащих тестов к наличию ВА варьирует в широких пределах, так как до сих пор содержание и состав фосфолипидов в коммерчески доступных реагентах не стандартизовано. Так как наличие тромбоцитарных мембран влияет на результаты тестирования, необходимо диагностику ВА проводить в плазме, лишенной тромбоцитов [2, 7, 8, 11, 13].
Целью данной работы является оценка созданной панели реагентов для диагностики ВА в условиях Международного Внешнего Контроля Качества. Точность и правильность предлагаемой совокупности методов оценивалась по данным программы ECAT Foundation, Нидерланды.
Материалы и методы. В нашем исследовании были применены коагулологические методы, утвержденные Стандартами Предприятия ГНЦ РАМН [4,5] и панель реагентов (производство НПО РЕНАМ).
Для определения ВА использовали тесты АЧТВ, ПВ (протромбиновое время с разбавленным тромбопластином), время разбавленного яда гадюки Рассела (dRVVT или ВА). Методы подразделялись на скрининговые (с использованием реагентов с низким содержанием фосфолипидов: AЧТВс, ВАс и ПВс) и подтверждающие (с использованием реагентов с высоким содержанием фосфолипидов: АЧТВп, ВАп и ПВп). Для проведения тестов со смешением плазм использовали скрининговые реагенты. Для контроля качества проведения анализов использовали нормальную плазму и контрольные плазмы с различным уровнем ВА, производства НПО Ренам и Dade Behring (Германия). Нормальные значения (М±2 SD) составляли для АЧТВс – 30-40сек, АЧТВп – 25-35сек, ПВс – 45-60 сек, ПВп – 14-18 сек, ВАс – 22-29 сек, ВАп – 20-26 сек.
Диагностику ВА проводили по рекомендуемому Подкомитетом по Волчаночному Антикоагулянту алгоритму. Результаты скрининговых тестов (АЧТВс, ПВс, ВАс) выражали в виде скрининговых отношений СО=То/Тн, где То – время свертывания опытной плазмы, Тн – время свертывания нормальной плазмы (пулированная бестромбоцитарная донорская плазма или коммерческая нормальная донорская плазма). При СО или = 1,2 проводили тесты со смешением плазм. Рассчитывали СО смеси плазм (сп) в виде СОсп=Тсп/Тн. Величина СОсп1,2 – о наличие в исследуемой плазме специфических ингибиторов факторов свертывания крови или неспецифических – ВА. Для решения вопроса о природе присутствующего в исследуемой плазме ингибитора, проводили подтверждающие тесты с добавлением к исследуемой плазме избытка компенсирующих фосфолипидов (АЧТВп, ПВп, ВАп). Результаты выражали в виде подтверждающего отношения ПО=То/Тн. Решение о наличие ВА принимали после расчета нормализованного отношения НО=СО/ПО для каждого теста. При значении НО>1,2 даже в одном тесте исследуемый образец плазмы считали положительным по ВА.
Результаты и обсуждение. Оценку результатов примененных методов выявления ВА на основе созданной панели реагентов осуществляли в течение трех лет (2005-2007 г.г) по программе Внешнего Контроля Качества. Исследовали 9 образцов Международной программы ECAT Foundation, Нидерланды. В определении ВА участвовало по программе ECAT 250-330 лабораторий (по отдельным пробам). Пробы представляли собой плазму больных с возможным или установленным наличием ВА. ЕСАТ статистически анализировала результаты определения АЧТВ, ПВ и dRVVT в скрининговых, подтверждающих тестах и тестах со смешением плазм по всем участвующим лабораториям для каждой исследуемой пробы. Конечные результаты анализа представлялись в виде допустимых значений (М±3SD) по величинам трех нормализованных отношений для используемых тестов, и по количеству лабораторий, делавших вывод или об отсутствии ВА или о наличии ВА различной степени выраженности. Данные анализа ЕСАТ позволяют оценить правильность выявления ВА каждым участником программы по всем тестам и в целом. Коэффициент межлабораторных вариаций нормализованных отношений по данным ЕСАТ составлял 14-39%.
Соотношение полученных нами результатов определения ВА в исследуемых образцах с таковыми всех участников программы ЕСАТ представлено в таблицах 1 и 2.
Таблица 1. Допустимые пределы и полученные нормализованные отношения (НО) по трем тестам.
№
образца
Допустимые
пределы
Нормализованное отношение (НО) для теста:
АЧТВ
ПВ
ВА
Образцы со слабо (вероятно) положительным ВА*
07.21
0,70-2,0
1,11
1,33
1,04
05.51
0,53-2,88
1,21
1,01
0,85
06.06
0,79-2,6
1,1
1,19
1,1
06.53
0,5-8,5
1,17
1,06
1,16
Образцы с положительным (резко положительным) ВА*
05.36
0,53-3,42
1,12
1,06
1,8
06.38
0,32-5,3
1,25
1,38
1,03
07.06
0,7-4,3
1,41
1,74
1,84
06.21
0,36-4,6
1,15
1,44
1,04
07.40
0,61-4,05
1,42
1,58
1,40
Таблица 2. Коэффициент вариаций и количество лабораторий с определенным диагностическим выводом при исследовании пробы
№
образца
КВ,%
Отрицательный
Погра-
ничный
Верояно
полож.
Положи-
тельный
Резко
полож.
Наш
рез-т
Образцы со слабо (вероятно) положительным ВА*
07.21
14,5
133
51
64
57
5
+
05.51
14,2
32
31
61
120
26
+
06.06
14,4
44
41
58
112
19
—
06.53
39,3
57
46
56
111
14
—
Образцы с положительным (резко положительным) ВА*
05.36
17,9
1
6
10
125
126
+
06.38
21,7
3
3
27
167
76
+
07.06
20,9
0
2
2
103
180
+
06.21
22,2
4
7
21
166
81
+
07.40
23,5
4
0
6
101
181
++
Анализ представленных в таблицах данных свидетельствует о том, что применение созданной тест-панели реагентов НПО РЕНАМ обеспечило получение значений нормализованных отношений (НО), не выходящих за пределы допустимых значений статистических данных ЕСАТ.
Из 9 исследованных опытных проб в 7 случаях полученные нами результаты совпадали с таковыми подавляющего количества участвующих лабораторий. В 2 пробах (06.06 и 06.53) проведенный нами анализ свидетельствовал об отсутствие в данных плазмах ВА. Обе пробы относились по конечной идентификации ЕСАТ к “слабо положительным” по титру ВА. Такой же вывод был сделан в 44 лабораториях по образцу 06.06 и в 57 лабораториях по образцу 06.53. Количество лабораторий с “отрицательным” диагнозом по отношению к числу лабораторий, характеризующих эти пробы как “положительные” и “резко положительные” составляло 33,6% и 45,6% для проб 06.06 и 06.53, соответственно. Необходимо отметить, что результаты анализа пробы 06.53 программой ЕСАТ характеризуются большим разбросом допустимых значений НО (0,5-8,5) и высоким коэффициентом вариации (39,3%). Эти процентные отношения и характер результатов, полученных лабораториями-участниками, указывают на то, что проведенный нами анализ указанных опытных проб не является грубо ошибочным и его “отрицательный” результат может быть обусловлен сложным гемостатическим составом исследуемых образцов плазмы.
Анализ всех данных ЕСАТ по двум группам анализируемых нами 9 проб: слабо (вероятно) положительные и положительные (резко положительные), свидетельствует о том, что значения коэффициента вариации не различается между данными группами (в среднем 20,1 и 21,2%, соответственно). Однако, соотношение количества лабораторий, характеризующих пробы с низким титром ВА как “отрицательные” и “положительные” равно 1:1,6. Данное отношение числа лабораторий при анализe проб с высоким содержанием ВА было равно 1:46. Этот факт указывает на сложность правильной диагностики больных с низким титром ВА в международном масштабе, что предполагает необходимость дальнейшего повышения качества определения ВА. В частности, большой процент лабораторий, идентифицирующих образцы с низким тит-ром ВА как “отрицательные” указывает на недостаточную чувствительность используемых ими реагентов. Данное положение, а также отсутст-вие утвержденной стандартизации состава и содержания фосфолипидов в диагностических панелях реагентов (во многом определяющих эффективность реагентов и методов диагностики) предполагают целесообразность разработок новых высоко чувствительных ВА-диагностикумов.
С использованием разработанной панели реагентов и общепринятого методического алгоритма была проведена диагностика ВА у 28 больных. Полученные во всех случаях результаты получили клиническое подтверждение.
Таким образом, данные Международного Внешнего Контроля Качества свидетельствуют о правильности диагностики ВА с помощью созданной панели реагентов (производство НПО РЕНАМ, Москва), так как полученные нами результаты преимущественно совпадали с таковыми большинства лабораторий-участников программы ЕСАТ.
РЕНАМ, НПО
125167, Москва, Новый Зыковский пр-д, д. 4а,
Гематологический Научный Центр РАМН
Тел./факс: (495) 614-90-57, 612-29-12,
E-mail: renam@blood.ru, www.renam.ru
Ведущий российский производитель и распространитель диагностических наборов и тест-систем для гемоглобинометрии и исследования системы гемостаза, а также контрольных материалов для гематологических анализаторов. Компания является поставщиком контрольных материалов для Федеральной системы внешней оценки качества лабораторных исследований МЗ РФ. Принимает активное участие в программе Международной службы внешнего контроля качества Великобритании по коагулологии.
