Применение ПЦР в диагностике бруцеллеза.
< -->
Бруцеллез до настоящего времени является одним из наиболее распространенных зоонозных инфекционных заболеваний, особенно в регионах с интенсивно развитым животноводством. Для осуществления эффективного надзора за активностью эпизоотических и эпидемических факторов в эндемичных по бруцеллезу регионах используются лабораторные методы исследования. Противоэпидемические мероприятия включают в себя изучение возбудителя инфекции и источник его распространения. Одним из наиболее эффективных показателей является выделение возбудителя заболевания. Бруцеллы являются грамотрицательными, факультативными, внутриклеточными патогенами, вызывающими заболевание у большого числа животных и человека. Род Brucella включает 7 видов: B. abortus, B. suis, B. melitensis B. neotomae, B. ovis, B. canis а также новый вид – B.maris, различающихся по биохимическим, метаболическим, антигенным и вирулентным характеристикам. Наиболее патогенными для человека являются первые три вида бруцелл; B. neotomae и B. ovis не вызывают заболеваний у людей, в то время как B. canis и B.maris могут вызывать патологический процесс у человека. При выделении культуры микроорганизмов в первую очередь необходимо их идентифицировать, для чего используются различные методы. Таксономическая характеристика бруцелл, помимо морфологических, культуральных, метаболических и серологических свойств возбудителя, включает также биохимические (характеристики белков бруцелл, составов фосфолипидов и липополисахаридов клеточной стенки) и генетические (показатель соотношения Г+Ц состава в ДНК равный 56-58моль% и гомологии ДНК в реакции ДНК-ДНК гибридизации до 90%) с тестерными штаммами. Все вышеперечисленные методы весьма трудоемки, требуют значительного количества средств и времени, кроме того, некоторые из них недостаточно специфичны, что требует проведения комплексных исследований. В настоящее время для детекции и идентификации бруцелл и лабораторного подтверждения диагноза используются молекулярно-биологические методы исследования, в частности метод Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР), позволяющий в короткие сроки (в течение рабочего дня) определить наличие специфической последовательности ДНК бруцелл в пробах как клинического, так и полевого материала. ПЦР проявила себя как высокоспецифичный и чувствительный метод лабораторного диагноза в случае острого и хронического бруцеллеза у людей и бруцеллеза у крупного рогатого скота, превосходящий по чувствительности и специфичности бактериологический и традиционные серологические тесты. В тест-системе для постановки ПЦР используют праймеры, синтезированные на основе последовательности гена BCSP31, кодирующего поверхностный белок наружной мембраны B.abortus размером 31 кД [ 2 ]. Последовательность этого гена является идентичной для всех видов бруцелл и поэтому, эти праймеры являются родо-, а не видоспецифичными. Родоспецифические праймеры: прямой праймер Br1 5`- AGT CAG ACG TTG CCT ATT G–3` и обратный праймер Br2 5`- GTG TTC AGC CTT GAT ATC G–3` фланкировали фрагмент ДНК размером 260 п.н. и обеспечивали высокую специфичность ПЦР. После подтверждения специфичности реакции данные праймеры были использованы для определения чувствительности метода. С этой целью была осуществлена постановка ПЦР с лизатами, содержащими в различных концентрациях клетки бруцелл всех видов. Количество вносимых клеток определяли титрованием суспензий на твердой питательной среде. Применение праймеров Br1 и Br2 позволило выявить специфический фрагмент 260 н.п. во всех образцах лизатов, полученных из 10 клеток бруцелл. Изучение чувствительности тест-системы при индикации бруцелл в объектах внешней среды и биологических объектах было проведено на пробах, искусственно контаминированных B.abortus 99 и B.suis 1330 в различных концентрациях. По мере уменьшения числа микробных тел в пробах снижался процент положительных результатов, однако оставался значительным даже при исследовании проб, содержащих десять клеток. Практическое использование ПЦР с целью идентификации возбудителя бруцеллеза было проведено при изучении 10 штаммов неидентифицированных микроорганизмов, которые были выделены от больных собак и, предположительно, отнесены к роду Brucella. Культуры были выделены от собак, находящихся в питомниках и частном секторе. Использование ПЦР позволило в течение одного дня установить их принадлежность к бруцеллам, а изучение фенотипических свойств показало, что выделенные от собак культуры являются бруцеллами вида B. canis. Оценка эффективности ПЦР в лабораторной диагностике бруцеллеза, как в клинической, так и эпидемиологической практике была осуществилена при параллельном исследовании 671 образца сывороток крови людей, больных различными формами бруцеллеза, лиц профессионально связанных с сельскохозяйственными животными и продуктами животноводства, а также лиц, обследованных по эпидпоказаниям. Образцы сывороток тестировали с помощью ПЦР и серологических реакций (РА, РК, РПГА, РХ и ИФА). В образцах сывороток определяли специфические антитела с помощью реакций: пробирочной агглютинации (РА), пластинчатой Хеддльсона (РХ), Кумбса (РК), пассивной гемагглютинации (РПГА), иммуноферментного анализа (ИФА) по общепринятым методикам. При тестировании сывороток крови людей, больных острой (I группа), подострой (II группа) и хронической формой (III группа) бруцеллеза с помощью ПЦР были получены положительные результаты практически у всех обследованных больных (96,3%, 100% и 95,9% соответственно). Следует отметить, что все больные были обследованы в период активного течения инфекционного процесса с выраженным клиническим течением, которые находились на стационарном лечении. Выраженные серологические реакции при этих формах заболевания подтверждали интенсивность инфекционного процесса. Обследование сотрудников лаборатории, постоянно контактирующих с живыми культурами бруцелл (IV группа) выявило наличие ДНК бруцелл во всех образцах сывороток. Все сотрудники лаборатории были ранее вакцинированы живой бруцеллезной вакциной из штамма B.abortus 19BA, а один сотрудник болен хронической формой бруцеллеза. При обследовании этой группы лиц наличие ДНК бруцелл с помощью ПЦР определяли одновременно в образцах цельной крови, сыворотке и моче. ДНК была выявлена во всех образцах цельной крови и сыворотке и ни в одной из проб мочи (выделение ДНК из мочи проводили по специальной методике). Нами также были обследованы работники биокомбината ( группа V), на котором изготавливают живые бруцеллезные вакцины из штаммов B.abortus 19 и 82, используемые в ветеринарной практике. В 91,1% случаев результаты ПЦР были положительными. Следует отметить, что в сыворотках крови специфические антитела во всех серологических тестах были выявлены практически у всех обследованных. Полученные данные свидетельствуют об инфицированности сотрудников вакцинными штаммами. У большинства обследованных были выявлены признаки гиперчувствительности к бруцеллезному антигену. В системе эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией важное место занимает плановое серологическое обследование профессиональных групп, являющихся группами риска заболевания бруцеллезом. В этой связи нами были обследованы сотрудники мясокомбината, который является высоко технологичным современным предприятием, работающим на привозном, замороженном сырье и забой скота там не производится (группа VI). У четырех обследованных (2%) в сыворотке крови была выявлена ДНК бруцелл, а также специфические антитела. При последующем тщательном клиническом обследовании у этих сотрудников был диагностирован бруцеллез в хронической форме. Обследование сотрудников молочно-товарной фермы (группа VII), на которой животные были вакцинированы живой бруцеллезной вакциной B.abortus 82, позволило выявить ДНК бруцелл в образцах сывороток крови с помощью ПЦР в 89,3% случаев. При этом специфические антитела были выявлены в сыворотках крови 42,9% обследованных. ПЦР давала положительные результаты у большинства лиц, обследованных по эпидпоказаниям в очагах бруцеллеза среди мелкого (32,7%) и крупного (100%)рогатого скота (VIII и XI группы соответственно). Следует отметить, что в очаге бруцеллеза мелкого рогатого скота у лиц с положительными результатами ПЦР и серологических тестов было выявлено 6 случаев заболевания хронической формой бруцеллеза. В группе лиц, обследованных в очаге бруцеллеза крупного рогатого скота (частный сектор) у всех контактировавших с больным животным ПЦР была положительной. Ни в одном случае не были выявлены специфические антитела и клинические проявления бруцеллезной инфекции. Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность ПЦР при эпидемиологическом надзоре за бруцеллезной инфекцией как в клинической, так и эпидемиологической практике. ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Однако очень высокая чувствительность ПЦР требует тщательного подхода к клинической интерпретации результатов. Необходимо учитывать тот факт, что попадание возбудителя бруцеллеза в организм человека может не вызывать развитие инфекционного процесса (Elberg 1980) особенно при контакте с малыми дозами слабо патогенных видов бруцелл. Кроме того, в России значительное число сельскохозяйственных животных ежегодно прививается против бруцеллеза. При этом используются живые бруцеллезные вакцины, которые создают нестерильный иммунитет и длительное время вакцинный штамм выделяется в окружающую среду. Лица, обслуживающие этих животных, также контактируют с вакцинными штаммами и могут быть носителями и иметь положительный ответ в ПЦР. Аналогичная ситуация может создаваться на предприятиях, где производится забой вакцинированных животных и выработка продуктов животноводства. То же самое возможно и при употреблении в пищу непастеризованных молочных продуктов. Это необходимо учитывать при получении положительных результатов ПЦР без клинических проявлений и положительных результатов серологических тестов. В этих случаях важное значение приобретает тщательно собранный эпидемиологический анамнез и комплексное клинико-лабораторное обследование пациента. Высокая специфичность ПЦР может помочь при проведении дифференциальной диагностики бруцеллеза и других инфекционных заболеваний, возбудители которых имеют общие антигенные детерминанты с бруцеллами.
М.М. Желудков, Кулаков Ю.К., Н.В. Алексеева.
