АТ к возбудителю бруцеллеза(РПГА,титр)

Применение ПЦР в диагностике бруцеллеза.

< -->

Бруцеллез до настоящего времени является одним из наиболее распространенных зоонозных инфекционных заболеваний, особенно в регионах с интенсивно развитым животноводством. Для осуществления эффективного надзора за активностью эпизоотических и эпидемических факторов в эндемичных по бруцеллезу регионах используются лабораторные методы исследования. Противоэпидемические мероприятия включают в себя изучение возбудителя инфекции и источник его распространения. Одним из наиболее эффективных показателей является выделение возбудителя заболевания. Бруцеллы являются грамотрицательными, факультативными, внутриклеточными патогенами, вызывающими заболевание у большого числа животных и человека. Род Brucella включает 7 видов: B. abortus, B. suis, B. melitensis B. neotomae, B. ovis, B. canis а также новый вид – B.maris, различающихся по биохимическим, метаболическим, антигенным и вирулентным характеристикам. Наиболее патогенными для человека являются первые три вида бруцелл; B. neotomae и B. ovis не вызывают заболеваний у людей, в то время как B. canis и B.maris могут вызывать патологический процесс у человека. При выделении культуры микроорганизмов в первую очередь необходимо их идентифицировать, для чего используются различные методы. Таксономическая характеристика бруцелл, помимо морфологических, культуральных, метаболических и серологических свойств возбудителя, включает также биохимические (характеристики белков бруцелл, составов фосфолипидов и липополисахаридов клеточной стенки) и генетические (показатель соотношения Г+Ц состава в ДНК равный 56-58моль% и гомологии ДНК в реакции ДНК-ДНК гибридизации до 90%) с тестерными штаммами. Все вышеперечисленные методы весьма трудоемки, требуют значительного количества средств и времени, кроме того, некоторые из них недостаточно специфичны, что требует проведения комплексных исследований. В настоящее время для детекции и идентификации бруцелл и лабораторного подтверждения диагноза используются молекулярно-биологические методы исследования, в частности метод Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР), позволяющий в короткие сроки (в течение рабочего дня) определить наличие специфической последовательности ДНК бруцелл в пробах как клинического, так и полевого материала. ПЦР проявила себя как высокоспецифичный и чувствительный метод лабораторного диагноза в случае острого и хронического бруцеллеза у людей и бруцеллеза у крупного рогатого скота, превосходящий по чувствительности и специфичности бактериологический и традиционные серологические тесты. В тест-системе для постановки ПЦР используют праймеры, синтезированные на основе последовательности гена BCSP31, кодирующего поверхностный белок наружной мембраны B.abortus размером 31 кД [ 2 ]. Последовательность этого гена является идентичной для всех видов бруцелл и поэтому, эти праймеры являются родо-, а не видоспецифичными. Родоспецифические праймеры: прямой праймер Br1 5`- AGT CAG ACG TTG CCT ATT G–3` и обратный праймер Br2 5`- GTG TTC AGC CTT GAT ATC G–3` фланкировали фрагмент ДНК размером 260 п.н. и обеспечивали высокую специфичность ПЦР. После подтверждения специфичности реакции данные праймеры были использованы для определения чувствительности метода. С этой целью была осуществлена постановка ПЦР с лизатами, содержащими в различных концентрациях клетки бруцелл всех видов. Количество вносимых клеток определяли титрованием суспензий на твердой питательной среде. Применение праймеров Br1 и Br2 позволило выявить специфический фрагмент 260 н.п. во всех образцах лизатов, полученных из 10 клеток бруцелл. Изучение чувствительности тест-системы при индикации бруцелл в объектах внешней среды и биологических объектах было проведено на пробах, искусственно контаминированных B.abortus 99 и B.suis 1330 в различных концентрациях. По мере уменьшения числа микробных тел в пробах снижался процент положительных результатов, однако оставался значительным даже при исследовании проб, содержащих десять клеток. Практическое использование ПЦР с целью идентификации возбудителя бруцеллеза было проведено при изучении 10 штаммов неидентифицированных микроорганизмов, которые были выделены от больных собак и, предположительно, отнесены к роду Brucella. Культуры были выделены от собак, находящихся в питомниках и частном секторе. Использование ПЦР позволило в течение одного дня установить их принадлежность к бруцеллам, а изучение фенотипических свойств показало, что выделенные от собак культуры являются бруцеллами вида B. canis. Оценка эффективности ПЦР в лабораторной диагностике бруцеллеза, как в клинической, так и эпидемиологической практике была осуществилена при параллельном исследовании 671 образца сывороток крови людей, больных различными формами бруцеллеза, лиц профессионально связанных с сельскохозяйственными животными и продуктами животноводства, а также лиц, обследованных по эпидпоказаниям. Образцы сывороток тестировали с помощью ПЦР и серологических реакций (РА, РК, РПГА, РХ и ИФА). В образцах сывороток определяли специфические антитела с помощью реакций: пробирочной агглютинации (РА), пластинчатой Хеддльсона (РХ), Кумбса (РК), пассивной гемагглютинации (РПГА), иммуноферментного анализа (ИФА) по общепринятым методикам. При тестировании сывороток крови людей, больных острой (I группа), подострой (II группа) и хронической формой (III группа) бруцеллеза с помощью ПЦР были получены положительные результаты практически у всех обследованных больных (96,3%, 100% и 95,9% соответственно). Следует отметить, что все больные были обследованы в период активного течения инфекционного процесса с выраженным клиническим течением, которые находились на стационарном лечении. Выраженные серологические реакции при этих формах заболевания подтверждали интенсивность инфекционного процесса. Обследование сотрудников лаборатории, постоянно контактирующих с живыми культурами бруцелл (IV группа) выявило наличие ДНК бруцелл во всех образцах сывороток. Все сотрудники лаборатории были ранее вакцинированы живой бруцеллезной вакциной из штамма B.abortus 19BA, а один сотрудник болен хронической формой бруцеллеза. При обследовании этой группы лиц наличие ДНК бруцелл с помощью ПЦР определяли одновременно в образцах цельной крови, сыворотке и моче. ДНК была выявлена во всех образцах цельной крови и сыворотке и ни в одной из проб мочи (выделение ДНК из мочи проводили по специальной методике). Нами также были обследованы работники биокомбината ( группа V), на котором изготавливают живые бруцеллезные вакцины из штаммов B.abortus 19 и 82, используемые в ветеринарной практике. В 91,1% случаев результаты ПЦР были положительными. Следует отметить, что в сыворотках крови специфические антитела во всех серологических тестах были выявлены практически у всех обследованных. Полученные данные свидетельствуют об инфицированности сотрудников вакцинными штаммами. У большинства обследованных были выявлены признаки гиперчувствительности к бруцеллезному антигену. В системе эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией важное место занимает плановое серологическое обследование профессиональных групп, являющихся группами риска заболевания бруцеллезом. В этой связи нами были обследованы сотрудники мясокомбината, который является высоко технологичным современным предприятием, работающим на привозном, замороженном сырье и забой скота там не производится (группа VI). У четырех обследованных (2%) в сыворотке крови была выявлена ДНК бруцелл, а также специфические антитела. При последующем тщательном клиническом обследовании у этих сотрудников был диагностирован бруцеллез в хронической форме. Обследование сотрудников молочно-товарной фермы (группа VII), на которой животные были вакцинированы живой бруцеллезной вакциной B.abortus 82, позволило выявить ДНК бруцелл в образцах сывороток крови с помощью ПЦР в 89,3% случаев. При этом специфические антитела были выявлены в сыворотках крови 42,9% обследованных. ПЦР давала положительные результаты у большинства лиц, обследованных по эпидпоказаниям в очагах бруцеллеза среди мелкого (32,7%) и крупного (100%)рогатого скота (VIII и XI группы соответственно). Следует отметить, что в очаге бруцеллеза мелкого рогатого скота у лиц с положительными результатами ПЦР и серологических тестов было выявлено 6 случаев заболевания хронической формой бруцеллеза. В группе лиц, обследованных в очаге бруцеллеза крупного рогатого скота (частный сектор) у всех контактировавших с больным животным ПЦР была положительной. Ни в одном случае не были выявлены специфические антитела и клинические проявления бруцеллезной инфекции. Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность ПЦР при эпидемиологическом надзоре за бруцеллезной инфекцией как в клинической, так и эпидемиологической практике. ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Однако очень высокая чувствительность ПЦР требует тщательного подхода к клинической интерпретации результатов. Необходимо учитывать тот факт, что попадание возбудителя бруцеллеза в организм человека может не вызывать развитие инфекционного процесса (Elberg 1980) особенно при контакте с малыми дозами слабо патогенных видов бруцелл. Кроме того, в России значительное число сельскохозяйственных животных ежегодно прививается против бруцеллеза. При этом используются живые бруцеллезные вакцины, которые создают нестерильный иммунитет и длительное время вакцинный штамм выделяется в окружающую среду. Лица, обслуживающие этих животных, также контактируют с вакцинными штаммами и могут быть носителями и иметь положительный ответ в ПЦР. Аналогичная ситуация может создаваться на предприятиях, где производится забой вакцинированных животных и выработка продуктов животноводства. То же самое возможно и при употреблении в пищу непастеризованных молочных продуктов. Это необходимо учитывать при получении положительных результатов ПЦР без клинических проявлений и положительных результатов серологических тестов. В этих случаях важное значение приобретает тщательно собранный эпидемиологический анамнез и комплексное клинико-лабораторное обследование пациента. Высокая специфичность ПЦР может помочь при проведении дифференциальной диагностики бруцеллеза и других инфекционных заболеваний, возбудители которых имеют общие антигенные детерминанты с бруцеллами.
М.М. Желудков, Кулаков Ю.К., Н.В. Алексеева.

Комментариев пока нет.

Добавить комментарий


About Беркегейм Михаил

Я родился 23 ноября 1945 года в Москве. Учился в школе 612. до 8 класса. Мама учитель химии. Папа инженер. Я очень увлекался химией и радиоэлектроникой. Из химии меня очень увлекала пиротехника. После взрыва нескольких помоек , я уже был на учете в детской комнате милиции. У меня была кличка Миша – химик. Из за этого после 8 класса дед отвел меня в 19 мед училище. Где меня не знали. Мой отчим был известный врач гинеколог. В 1968 году я поступил на вечерний факультет медицинского института. Мой отчим определил мою профессию. Но увлечение электроникой не прошло, и я получил вторую специальность по электронике. Когда я стал работать врачом гинекологом в медицинском центре «Брак и Семья» в 1980 году, я понял., что важнейшим моментом в лечении бесплодия является совмещение по времени секса и овуляции. Мне было известно, что овуляция может быть в любое время и несколько раз в месяц. И самое главное, что часто бывают все признаки овуляции. Но ее не происходит. Это называется псевдоовуляция. Меня посетила идея создать прибор надежно определяющий овуляцию. На это ушло около 20 лет. Две мои жены меня не поняли. Я мало времени уделял семье. Третья жена уже терпит 18 лет. В итоге прибор получился. Этот прибор помог вылечить бесплодие у очень многих женщин…
×
Записаться на приём или задать вопрос