Влияние возраста женщины на результаты Эко.Влияние возраста женщины на процесс оплодотворения ооцитов и развитие эмбрионов в культурВлияние возраста женщины еО.А.Воробьева, В.С.Корсак, Е.Л.Северова, А.А.Кирсанов, В.В.КозловНИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН, Международный центр репродуктивной медицины, Санкт-Петербург Проблемы репродукции, N6-1998, с.46-49 Проанализировано влияние возраста женщины на процессы оплодотворения ооцитов и дробления эмбрионов в культуре в программе ЭКО. В группе женщин от 20 до 39 лет не выявлено каких-либо различий в частоте оплодотворения, полиплоидии и доле зигот, вступивших в развитие.  Тенденции к снижению способности ооцитов к оплодотворению отмечены у женщин 40 лет и старше. В то же время установлено, что возраст является фактором, отрицательно влияющим на развитие эмбрионов в культуре. В частности, с возрастом наблюдаются постепенное закономерное замедление темпа дробления эмбрионов и усиление фрагментации цитоплазмы бластомеров.Ключевые слова: фолликулы, ооциты, эмбрионы, ЭКО.Одним из значительных достижений уходящего столетия без сомнения можно считать изменение социального положения женщин во многих странах мира. Получение образования, карьера, достижение определенного общественного статуса потребовали от них изменения отношения к такому важнейшему предназначению, как продолжение рода.  Откладывание рождения ребенка на более поздний период жизни привело к тому, что к моменту, когда женщина решается на этот шаг, ее возможности в репродукции весьма ограничены. Бесплодие является другой причиной, по которой женщины старшего возраста продолжают поиск путей к рождению ребенка. Решение этих проблем предлагается врачам и биологам.ЭКО (экстракорпоральное оплодотворение) открыло новые возможности в области репродукции. С помощью этого метода стало реальным не только преодолеть бесплодие, но и подойти к изучению ряда биологических феноменов с новых позиций. Не все из известных методов оценки гамет и эмбрионов могут быть использованы в клинической программе ЭКО в полной мере. Так, детальное исследование морфологических характеристик яйцеклетки невозможно из-за опасности ее повреждения.  По этой причине о качестве яйцеклетки судят по ее функциональным характеристикам, т.е. способности к нормальному оплодотворению и дальнейшему развитию. При этом исходят из того, что первые деления дробления регулируются факторами яйцеклетки, а влияние мужского генома начинает проявляться на стадии 4-8 бластомеров [1]. В этой связи исследование особенностей оплодотворения ооцитов и последующего развития эмбрионов можно рассматривать как способ оценки ооцитов.Данные литературы о влиянии возраста женщины на процессы оплодотворения яйцеклеток и развитие эмбрионов человека в культуре достаточно противоречивы. M.Hull и соавт. [2] при анализе результатов 561 процедуры ЭКО у женщин в возрасте от 25 до 44 лет с первой попыткой лечения, имевших овуляторный цикл и нормальные показатели спермограммы мужа, не выявили зависимости частоты оплодотворения ооцитов от возраста пациенток. По мнению американских исследователей возраст не влияет на процессы фрагментации и число бластомеров у эмбрионов [3]. Этими авторами отмечено, что единственным морфологическим признаком эмбрионов, который при этом изменяется, является толщина блестящей оболочки. В то же время A.Stolwijk и соавт. [4] показали, что с возрастом уменьшается число перенесенных эмбрионов с нормальной морфологией.  Задачей настоящей работы явилось изучение влияния возраста женщины на процессы оплодотворения, характер формирования зигот, темп дробления эмбрионов, степень фрагментации бластомеров.Материал и методыПроанализированы результаты оплодотворения ооцитов в культуре у 774 женщин, проходивших лечение методом ЭКО в нашем центре. Показанием к ЭКО у всех больных явилось трубно-перитонеальное бесплодие вследствие непроходимости или отсутствия маточных труб. Возраст больных варьировал от 20 до 46 лет и составлял в среднем 30,8 0,1 года. Показатели спермограммы у их мужей были нормальными.  Стимуляцию суперовуляции проводили с использованием кломифенцитрата (клостилбегит) и человеческого менопаузального гонадотропина (хумегон, пергонал). Для индукции овуляции вводили хорионический гонадотропин при достижении лидирующими фолликулами диаметра 17-18 мм.В среднем было пунктировано 7,74 0,14 фолликула и получено 5,58 0,11 ооцита. Ооциты отмывали и культивировали в среде Ham-F10 с альбумином человека в течение 6 ч. Для инсеминации вводили 100 000 сперматозоидов в 1 мл среды. Через 18 ч определяли число пронуклеусов в зиготах, при этом полиплоиды удаляли, а нормальные зиготы переносили в свежую среду. Через 24 ч с момента контроля оплодотворения (первая оценка) эмбрионы анализировали под микроскопом и определяли число бластомеров. Выделяли три основные типа эмбрионов — без фрагментации бластомеров, а также с легкой и тяжелой степенью фрагментации цитоплазмы. Эмбрионы первой группы характеризовались индексом фрагментации 3, второй — 2 и третьей — 1.  Вторая оценка развития эмбрионов происходила перед переносом их в полость матки через 48 ч с момента контроля оплодотворения ооцитов.  Для переноса отбирали 4 эмбриона с наибольшим числом бластомеров и наименьшей степенью фрагментации цитоплазмы.  Всего проанализировано 2760 эмбрионов. Частоту оплодотворения вычисляли как отношение числа зигот к общему числу полученных ооцитов. Частоту дробления зигот определяли как отношение числа эмбрионов к общему числу полученных зигот. Частоту встречаемости полиплоидных зигот вычисляли по отношению числа полиплоидных зигот к общему числу ооцитов.Для анализа полученных данных использовали методы вариационного, дисперсионного, корреляционного и регрессионного (параметрического линейного, а также множественного) статистического анализа.РезультатыВ среднем при оплодотворении в культуре было получено 3,6 0,08 эмбриона, после отбора прогрессивно развивающихся было перенесено в полость матки 2,8 0,04 эмбриона. Частота оплодотворения в среднем составила 72,1 0,8%, частота дробления зигот — 94,3 0,5%, частота полиплоидных зигот — 5,5 0,4%.При использовании корреляционного анализа в группе пациенток от 20 до 39 лет не было выявлено зависимости частоты оплодотворения ооцитов от возраста женщины. Частота оплодотворения ооцитов в культуре была снижена только у женщин старше 39 лет. В данной возрастной группе этот показатель составил 61,5 8,4%, что достоверно ниже, чем у пациенток в возрасте 20-24 года (82,4 3,4%; р<0,05 ), а также 35-39 лет (80,8 2,1%; р<0,05). Частота дробления и частота образования полиплоидных зигот не зависели от возраста женщины (табл. 1).Таблица 1. Частота развития зигот и полиплоидии (в %) у женщин разных возрастных группПоказательВозраст женщины, годы20-2425-2930-3435-39>39Частота развития зигот93,1 2,193,4 1,195,3 1,0697,03 0,994,05 3,0Частота полиплоидии6,7 1,54,8 0,56,02 0,63,3 0,68,6 4,2Замедленный темп дробления, связанный с возрастом пациенток, отмечен нами при оценке эмбрионов через 24 ч (r = -0,08; р < 0,0001) и 48 ч (r = -0,11; р < 0,0001) после контроля оплодотворения. Развитие лучших эмбрионов, выбранных впоследствии для переноса в полость матки, проходило с той же закономерностью (табл. 2). При первой оценке коэффициент регрессии равнялся -0,096 (р < 0,0001), при второй составил -0,14 (р < 0,0001).Таблица 2. Влияние возраста женщины на развитие в культуре эмбрионов, впоследствии перенесенных в полость маткиПоказательВозраст женщины, годы20-2425-2930-3435-39>39Число бластомеровпервое наблюдение3,5 0,33,2 0,13,1 0,13,0 0,13,0 0,5второе наблюдение7,3 0,46,6 0,26,9 0,25,6 0,26,4 0,5аасaсИндекс фрагментациипервое наблюдение2,7 0,12,4 0,12,5 0,12,6 0,12,5 0,3второе наблюдение3,1 0,12,7 0,12,5 0,12,4 0,12,5 0,3b,cb,cb,cbcПримечание. Первое наблюдение — 24 ч после контроля оплодотворения, второе — 48 ч после контроля оплодотворения.  а — p <0,01, b — p <0,01, c — p <0,05.На рис. 1 приведена математическая модель зависимости числа бластомеров (при оценке всех полученных эмбрионов через 48 ч после контроля оплодотворения) от возраста женщины. Эта зависимость носит линейный характер и свидетельствует о постепенном закономерном снижении числа бластомеров с возрастом.Рис. 1. Зависимость числа бластомеров у эмбрионов через 48 ч с момента контроля оплодотворения от возраста женщины.  y = 9,22 — 0,1 * x R2 = 0,04; F = 12,94; p < 0,004.Достоверное повышение степени фрагментации с возрастом наблюдалось при оценке эмбрионов через 48 ч как среди всех полученных эмбрионов (r = -0,096; р < 0,0001), так и среди эмбрионов, перенесенных в полость матки (r = — 0,014; р < 0,00001) (см. табл. 2). Повышение степени фрагментации (снижение индекса фрагментации) также носит линейный характер (рис. 2).Рис. 2. Зависимость индекса фрагментации эмбрионов через 48 ч с момента контроля оплодотворения от возраста женщины.  у = 3,68 — 0,04 * х R2 = 0,04; F = 13,45; p < 0,003.ОбсуждениеНа большой выборке при использовании высокоинформативных методов статистического анализа нами установлено, что параметры, характеризующие способность ооцитов к оплодотворению, не имеют существенных различий у женщин в возрасте от 20 до 39 лет. Снижение частоты оплодотворения яйцеклеток носит закономерный характер в группе женщин старше 39 лет. В то же время достаточно рано возраст женщин начинает сказываться на темпе дробления эмбрионов и на степени выраженности процесса фрагментации. По всей видимости, способность к оплодотворению у яйцеклетки остается ненарушенной дольше, чем сохранность механизмов, обеспечивающих нормальное развитие эмбриона.Одной из возможных причин, приводящих к нарушению развития эмбрионов у женщин старшей возрастной группы, может являться повышение уровня хромосомных аберраций в ооцитах. Так, нами была выявлена тенденция к увеличению числа гетероплоидных женских половых клеток с возрастом [5]. Эти данные совпадают с результатами работы, выполненной D.Battaglia и соавт. [6] на модели созревания ооцитов в культуре, в которой показано, что частота хромосомных аберраций в этих клетках у женщин в возрасте 40-45 лет составляет до 79%, а у молодых женщин (20-25 лет) — 17%. Аналогичные результаты были получены K.Volarcik и соавт. [7]. Частота хромосомных аберрации в ооцитах у женщин моложе 35 лет составляла 21%, а в возрасте 35 лет и старше — 71%. Такой высокий уровень хромосомных аберраций в ооцитах может приводить к нарушению эмбриогенеза. Известно, что до 60% эмбрионов, развитие которых блокируется на доимплантационной стадии (с сильной степенью фрагментации бластомеров) являются генетически неполноценными: анеуплоидными или мозаичными [8, 9].ВыводыЧастота оплодотворения ооцитов не изменяется у женщин в возрасте от 20 до 39 лет и постепенно снижается у женщин старше 40 лет. Частота формирования полиплоидных зигот и развития диплоидных не зависит от возраста. В то же время наблюдается постепенное снижение скорости дробления эмбрионов и повышение частоты их фрагментации.Литература1. Braude P., Bolton V., Moore S. Human gene expression first occurs between the four and eight-cell stages of preimplantation development. Nature 1988; 332: 459-461.  2. Hull M.G., Fleming C.F., Hughes A.O., McDermott A. The agerelated decline in female fecundity: a quantitative controlled study of implanting capacity and survival of individual embryos after in vitro fertilization. Fertil Steril 1996; 65: 783- 790.  3. Alikani M., Wiemer K. Embryo number for transfer should not be strictly regulated. Fertil Steril 1997; 68: 782-783.  4. Stolwijk A., Zielhuis G.A., Sauer M.V., Hamilton C.J., Paulson R.J. The impact of the womans age on the success of standard and donor in vitro fertilization. Fertil Steril 1997; 67: 702- 710.  5. Воробьева О.А., Кузнецова Т.В., Богомолова М.В., Баранов В.С.  Анализ частоты хромосомных аберраций в ооцитах человека. Пробл репрод 1997; 2: 21-26.6. Battaglia D.E., Goodwin P., Klein N.A. Influence of maternal age on meiotic spindle assembly in oocytes from naturally cycling women.  Hum Reprod 1996; 11: 2217-2222.7. Volarcik К., Sheean L., Goldfarb J., Woods L., Abdul-Karim F., Hunt P. The meiotic competence of in vitro matured human oocytes is influenced by donor age: evidence that folliculogenesis is compromised in the reproductively aged ovary. Hum Reprod 1998: 13: 154-160.8. Janny I., Menezo Y. Maternal age effect on early human embryonic development and blastocyst formation. Mol Reprod Dev 1996; 45: 31-37.9. Munne S., Rosenwaks Z., Grifo J., Cohen J. Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos. Hum Reprod 1993; 8: 2185-2191.10. Munne S., Grifo J., Cohen J., Weier H.-U.G. Chromosome abnormalities in human arrested preimplantation embryos: a multiple-probe FISH study. Am J Hum Genet 1994; 55: 150-159. Проблемы репродукции