Изучено влияние степени компактизации хроматина ядер сперматозоидов на процессы оплодотворения и развития эмбрионов в программе ЭКО.  Степень компактизации хроматина была проанализирована с помощью предложенного нами количественного проточно-цитофотометрического способа.Влияние аномальной организации хроматина сперматозоидов на развитие эмбрионов человека О.А. Воробьева, М.В. Филатов, О.А. Леонтьева, Е.В. Семенова Институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта, Центр ЭКО, Институт ядерной физики им. А.К. Константинова РАН, С.-Петербург В начало… Изучено влияние степени компактизации хроматина ядер сперматозоидов на процессы оплодотворения и развития эмбрионов в программе ЭКО.  Степень компактизации хроматина была проанализирована с помощью предложенного нами количественного проточно-цитофотометрического способа.Ключевые слова: ЭКО, сперматозоиды, организация хроматина, бесплодие, эмбрион.  Стандартные клинические методы диагностики нарушения сперматогенеза связаны с анализом концентрации сперматозоидов, их подвижности и морфологии [1]. В последние годы появился новый способ оценки строгой морфологии сперматозоидов, позволяющий предсказать частоту оплодотворения в культуре, а также были предложены методы определения способности cперматозоидов к связыванию c блестящей оболочкой ооцитов [2, 3]. Эти методы характеризуют причины, препятствующие слиянию половых клеток. Если бы все причины мужского бесплодия сводились только к подобным дефектам, то они легко преодолевались бы оплодотворением в культуре (экстракарпоральное оплодотворение — ЭКО). Применение ICSI (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида) должно было бы решить все проблемы. Несмотря на то, что ЭКО действительно облегчает слияние клеток, получить беременность иногда не удается даже после многократных попыток.  Возможно, одной из причин могут являться нарушения в самой организации переносимого генетического материала, что может препятствовать последующим за слиянием половых клеток процессам развития.В литературе существуют указания на корреляцию между нарушениями в организации ядер спермиев и их способностью к оплодотворению [4-7].  В настоящее время на практике используется методика оценки организации хроматина ядер спермиев, основанная на полихромной окраске ядер акридиновым оранжевым [8, 9]. Однако этот метод можно расценивать как эмпирический, поскольку механизм действия красителя не ясен, а методика окрашивания мало стандартизирована.  Нами разработан простой, легко интерпретируемый, количественный метод оценки интактности организации ядерного материала спермиев, пригодный для клинического использования. Основой метода явилось то, что ключевой момент плотной упаковки хроматина спермиев — поперечное сшивание протаминов дисульфидными связями — является завершающим этапом дифференцировки спермиев и важно для их функции. Для оценки степени компактизации хроматина ядер спермиев использовался эффект экранирования белками хроматина связывания с ДНК флюоресцентного красителя этидия бромида. Попытка экстрагировать из хроматина основные белки путем обработки полианионами (гепарином) без размыкания дисульфидных связей приводит к удалению той части белков, которая не была сшита поперечными ковалентными дисульфидными мостиками. В результате доступность ДНК для связывания этидия бромида возрастает. Таким образом, связывание этидия бромида с ДНК отдельных клеток, измеряемое методом проточной цитофлюорометрии, может служить мерой эффективности компактизации хроматина спермия в процессе дифференцировки.Данные о влиянии степени компактизации хроматина сперматозоидов на процессы оплодотворения и эмбрионального развития в культуре достаточно противоречивы. Большинство авторов считают, что тесты, оценивающие состояние хроматина мужских половых клеток, позволяют прогнозировать способность сперматозоидов к оплодотворению и могут иметь диагностическое значение [4]. Некоторые авторы не выявили взаимосвязи этих параметров [10]. В большинстве работ дается субъективная оценка состояния хроматина по степени окрашиваемости ядер анилиновым синим, акридиновым оранжевым или же по тесту на деконденсацию хроматина, что затрудняет интерпретацию полученных результатов. Использование флюорохрома хромомицина показало, что при наличии в эякуляте сперматозоидов с дефектами в организации хроматина повышается частота нарушения деконденсации их ядер в цитоплазме ооцитов после ICSI [5], а также уменьшается частота оплодотворения после инъекции сперматозоидов с помощью микроманипулятора под блестящую оболочку — SUZI [7].Материалы и методыМетодом проточной цитофотометрии проанализировано 176 образцов спермы пациентов, проходящих лечение бесплодия в программе ЭКО в Центре репродукции ЭКО (Институт акушерства и гинекологии РАМН и Чикагский институт репродуктивной генетики). Для получения зрелых яйцеклеток применяли стимуляцию фолликулогенеза с помощью гонадотропных гормонов [12]. Для культивирования использовали среду Ham F-10 с альбумином человека и синтетическим заменителем сыворотки фирмы «Medi-Cult» (Дания). Выделение прогрессивно подвижной фракции сперматозоидов проводили в перколле. Для оплодотворения в среду к ооцитам вводили 100 000 сперматозоидов. Оплодотворение определяли через 18 ч после введения сперматозоидов по наличию двух пронуклеусов. Частоту оплодотворения рассчитывали как отношение числа зигот к числу ооцитов. Вычисляли долю эмбрионов с нормальной морфологией — без фрагментации бластомеров. Число бластомеров в эмбрионах определяли через 24 и 48 ч после образования пронуклеусов.  Нормальными показателями спермограммы считали концентрацию сперматозоидов 20 млн и более в 1 мл, долю прогрессивно подвижной фракции более 40% и морфологически нормальных форм — более 40%.  Согласно нашей методике, степень компактизации хроматина характеризуют гистограммы распределения клеток по способности связывать краситель (этидия бромид) до и после обработки гепарином.  В норме почти все клетки окрашиваются одинаково и имеют низкую интенсивность флюоресценции, которая после обработки гепарином увеличивается примерно в 2 раза. Если у значительной части клеток (более 30) интенсивность флюоресценции повышена исходно либо после экстракции ковалентно несвязанных белков хроматина гепарином она возрастает в 2 раза и выше более чем у 50 клеток, то такие образцы спермы считали дефектными.Достоверность различий определяли по критерию Х2 и t-критерию Фишера.РезультатыНаиболее характерные проточно-цитофлюорометрические гистограммы приведены на рис. 1.Рис. 1. Характеристика состояния хроматина ядер сперматозоидов человека, полученная методом проточной цитофлюорометрии.  а — нормальное (1) и аномальное (2, 3) исходное распределение клеток по степени компактизации хроматина; б — аномальная реакция ядер сперматозоидов на воздействие гепарином; 1 — нативная сперма; 2, 3 — после воздействия гепарином.Основываясь на выработанных критериях, мы проанализировали 176 образцов спермы пациентов программы ЭКО. Все пациенты были разделены на две группы — с нормальной (1-я) и аномальной (2-я) степенью компактизации хроматина сперматозоидов. Также были выделены подгруппы с нормальными показателями сперматогенеза и с патоспермией. Средний возраст женщин в группах не различался и составлял 31,3 4,1 года в 1-й и 31,9 4,8 года во 2-й группе.  Полученные результаты приведены в табл. 1. Частота оплодотворения ооцитов у пациентов с нормальными показателями спермограммы не различалась независимо от состояния хроматина сперматозоидов. Однако у пациентов с измененными показателями спермограммы при аномальном характере хроматина частота оплодотворения снижалась по сравнению с пациентами, у которых этот параметр был в пределах нормы. Частота оплодотворения в культуре при патоспермии, но нормальном состоянии хроматина не отличалась от таковой при нормоспермии и составляла более 60%. Во всех подгруппах морфология эмбрионов не различалась по степени выраженности процесса фрагментации бластомеров. Для анализа влияния степени компактизации хроматина ядер сперматозоидов на динамику развития эмбрионов в культуре проанализировано число бластомеров в эмбрионах в различные сроки после начала культивирования у пациентов с нормальными показателями спермограммы.  Полученные данные приведены на рис. 2. Число бластомеров в эмбрионах после 24 и 48 ч культивирования было достоверно выше у пациентов с нормальным уровнем компактизации хроматина в сперматозоидах. Таким образом, при аномалиях в организации хроматина замедляется процесс дробления эмбрионов в культуре.Таблица 1. Состояние хроматина ядер сперматозоидов и результаты лечения бесплодия в программе ЭКО Программа ЭКОНормозооспермияПатозооспермия Состояние хроматина нормальноеаномальноенормальноеаномальное Число циклов ЭКО88511522 Число переносов эмбрионов82441414 Частота оплодотворения, %66 (396/596)62 (187/301)61 (57/93)33 (34/103)Случаи с отсутствием оплодотворения, %7 (6/88)12 (6/51)7 (1/15)32 (7/22)Частота развития зигот, %95 (376/396)98 (184/187)95 (54/57)91 (31/34)Частота нормального развития эмбрионов, %54 (204/376)53 (97/184)59 (32/54)48 (15/31)Частота беременностей на цикл, %23 (20/88)6 (3/51)13 (2/15)0 Частота беременностей на перенос, %24 (20/82)7 (3/44)14 (2/14)0 Примечание. В скобках — абсолютные показатели. Звездочкой отмечены достоверные различия — p < 0,05 (Х2) в сравнении снормальным состоянием хроматина.Сopyright © 2000-2005, РОО «Мир Науки и Культуры». ISSN 1684-9876