Пренатальное определение пола(Обзор литературы)И.Ю. Барков, В.А. Бахарев, Н.А. КаретниковаНаучный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, Москва Проблемы репродукции, N1-1999, с.5-14 Для большинства Х-сцепленных генетических заболеваний молекулярная или биохимическая природа дефекта продолжают оставаться неизвестными. Пренатальное установление пола является единственным выходом в этих ситуациях. Традиционными способами получения материала для пренатальной диагностики являются инвазивные методы: биопсия ворсин хориона, амниоцентез и другие. Анализ полученного в ходе процедуры материала может осуществляться как цитогенетически, так и посредством применения современных методов диагностики FISH и ПЦР. Установление пола плода этими методами возможно с 7 нед беременности. Поднимается вопрос об определении пола до этапа имплантации (при оплодотворении in vitro) и неинвазивного определения пола по плодному материалу в кровотоке матери и цервикальных мазках, а также другими методами.Ключевые слова: пренатальная диагностика, определение пола, половые хромосомы. В настоящее время известно более 300 наследственных заболеваний и признаков, передающихся сцепленно с полом. Для этих болезней характерна передача патологического гена обычно здоровыми женщинами-носительницами их сыновьям. При рождении мальчиков вероятность их поражения составляет 50%, в то время как девочки рождаются фенотипически здоровыми, но 50% из них являются носителями. К таким заболеваниям относятся гемофилия А и В, различные формы умственной отсталости, сцепленные с X хромосомой, например, синдром Мартина-Белла, прогрессирующие мышечные дистрофии Дюшенна и Беккера, нефрогенный несахарный диабет, некоторые формы гидроцефалии, X-сцепленная глухота и др. Когда биохимическая или молекулярная природа дефекта выявлена, возможна пренатальная диагностика заболевания биохимическим методом, с помощью анализа полиморфных маркеров или установления мутаций. Но и в этих случаях пренатальное определение пола следует рассматривать как предварительный этап перед дальнейшим анализом. Однако генез возникновения большинства X-сцепленных заболеваний остается неизвестным, и при пренатальном установлении мужского пола плода единственным выходом в таких ситуациях является прерывание беременности [1].Пренатальная диагностика пола плода осуществляется с помощью различных методов исследования и в тканях плодового происхождения: хорионе, амниотической жидкости, крови и др. Ее появлению в конце 60-х годов способствовало развитие генетики соматических клеток, позволившее создать метод определения пола плода, основанный на исследовании амниотической жидкости, получаемой посредством пункции околоплодного пузыря (амниоцентеза). Амниоцентез осуществляли с 16 нед беременности из-за технических сложностей и опасности травматизации плода иглой.В настоящее время, поскольку вся процедура проводится под ультразвуковым контролем, амниотическую жидкость можно получить начиная с 7 нед беременности [2]. Частота прерывания беременности после манипуляции не превышает 1%. Количество извлекаемой амниотической жидкости (1-40 мл) зависит от срока беременности и задач лабораторной диагностики.Кровь плода получают с помощью кордоцентеза или пункции сосудов пуповины [3]. Наиболее ранним гестационным возрастом плода, при котором извлечение его крови в количестве 1 мл не ведет к осложнениям, является 16 нед беременности. Поскольку в большинстве случаев требуется большее количество крови, манипуляцию проводят в более поздние сроки, вплоть до 27 нед беременности. При этом количество аспирированной крови колеблется от 1 до 5 мл, как правило, не приводя к отрицательным последствиям. Частота осложнений после кордоцентеза не превышает 2%. С конца 70-х годов широко применяется еще один способ получения ткани в I триместре беременности — биопсия ворсин хориона. Взятие ткани хориона осуществляется различными способами [4,5]. В последние годы основными из них являются трансцервикальный метод с помощью биопсийных щипцов малого диаметра (обычно 1,7 мм) или специального пластикового катетера — трофокана и трансабдоминальная аспирация хориона с использованием иглы и шприца. Проведение процедуры с целью получения хориональной ткани возможно после 7 нед беременности, однако оптимальными сроками ее проведения являются 8-10 нед беременности. Перед манипуляцией требуется ультразвуковое исследование для характеристики хориона, уточнения срока беременности, исключения возможных отклонений в ее развитии. Основным осложнением вмешательства является прерывание беременности, частота которого в настоящее время не превышает 2% благодаря выполнению процедуры под непосредственным ультразвуковым контролем. Количество материала зависит от метода его получения и колеблется от 1 до 35 мг.Имеются и другие, получившие меньшее распространение способы взятия плодного материала, применяемые для определения пола плода (биопсия кожи плода, аспирация крови плода посредством пункции плаценты и др.).Методы исследования полученного плодного материала с целью установления пола плода основываются на установлении наличия или отсутствия Y хромосомы, как фактора, определяющего мужской пол у человека. Наибольшее распространение для выявления Y хромосомы получил метод анализа метафазных хромосом (кариотипирование), обычно в сочетании с разработанным в конце 60-х годов методом дифференциальной окраски препаратов хромосом. Для получения достаточного для анализа количества метафаз клетки амниотической жидкости культивируют перед проведением исследования в течение нескольких недель. Применение биопсии ворсин хориона позволило не только заметно снизить сроки, в которые осуществляется взятие материала, но и сократить время, необходимое для анализа. Так как в биоптате имеется достаточное количество делящихся клеток и отпадает необходимость в длительном культивировании, проведение кариотипирования возможно в течение суток после получения материала. Помимо анализа метафазных хромосом применялось определение пола плода и путем исследования в интерфазных клетках X- или Y-хроматина. Достоверность установления пола по определению X-хроматина (телец Барра) составляла около 90% (обычно пол плода считали женским, если обнаруживали тельца Барра в 12-25% амниотических клеток). Несколько выше (около 96%) была точность установления пола путем выявления F-телец (Y-хроматина), наличие которых связано с флюоресценцией длинного плеча Y хромосомы, проявляющейся при окрашивании флюоресцентными красителями (в частности, акрихин-ипритом) в виде яркого пятна диаметром 0,3-1,0 мкм [6]. Следует отметить, что установление пола путем подсчета в интерфазных ядрах телец Барра или выявления в интерфазных клетках окрашенных флюоресцентными красителями Y хромосом в связи со значительной условностью в трактовании результатов анализа не имело той достоверности, которая достигалась при анализе метафазных препаратов, особенно с применением методов дифференциального окрашивания хромосом. Однако приготовление препаратов (особенно получение метафазных пластинок) и само проведение анализа продолжают оставаться крайне трудоемкой и длительной процедурой, мало изменившейся за 30 лет.Помимо этого, делались попытки проведения пренатальной диагностики пола с использованием материала плода, получаемого без инвазивного вмешательства, в частности с помощью исследования содержимого влагалища и различных отделов цервикального канала (табл. 1), а также установления пола по клеткам плода, предположительно попадающим во время беременности в материнский кровоток (табл. 2). Однако результаты таких попыток были крайне противоречивы, и применяемыми методами (в основном определение Y-хроматина) достигнуть в этом вопросе бесспорных успехов не удалось.Таблица 1. Выявление клеток плода в трансцервикальных образцахВыявленыНе выявленыL.Shettles [7]R.Warren и соавт. [8]R.Varner и соавт. [9]S.Rhine и соавт. [10]S.Rhine и соавт. [11]M.Bobrow и B.Lewis [12]K.Tsuji и M.Sasaki [13]A.Goldstein и соавт. [14]M.Manuel и соавт. [15]K.Amankwah и E.Bond [16]M.Goldberg и соавт. [17] Таблица 2. Выявление лимфоцитов плода в периферической крови матери (цитогенетический метод) 46,XY выявлены46,XY не выявлены J.Walkonowska и соавт. [18](30 наблюдений, 16,6% ошибок)J.De Grouchy и C.Trebuchet [19](21 наблюдение, 30% ошибок)A.Schindler и соавт. [20]J.Schroder и A. de la Chapelle [21](21 наблюдение, 28% ошибок)J.Schroder и соавт. [22](24 наблюдения, 25% ошибок)L.Grosset и соавт. [23](86 наблюдений, 13% ошибок)R.Zilliacus и соавт. (Y-хроматин) [24](18 наблюдений, 27% ошибок)J.Faust и соавт. (Y-хроматин) [25] (100 наблюдений, 15% ошибок)R.Angell и M.Adinolfi [26]P.Jacobs и P.Smith [27]A.Zimmerman и R.Schmickel [28]M.Adinolfi и D.Gorvette [29]R.Zilliacus и соавт. (metaphase) [30]J.Schroder и соавт. [31]В конце 80-х — начале 90-х годов стали интенсивно разрабатываться новые методы, позволяющие определять пол плода по значительно меньшему количеству используемого для анализа материала и обеспечить высокую точность без метафазного анализа хромосом. К ним, в первую очередь, относятся методы анализа ISH (в частности, FISH) и применение полимеразной цепной реакции (ПЦР). Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) [32,33] является методом быстрого проведения цитогенетической диагностики, основанным на специфичной гибридизации флюоресцентно-меченных зондов с определенными участками хромосом (обычно это расположенные в районе центромеры хромосомо-специфические альфоидные повторы). При применении этого метода обычный препарат с интерфазными или метафазными клетками подвергается тепловой денатурации в присутствии зонда, например, к Y хромосоме, меченного, как правило, биотином. Дальнейшая обработка препарата флюоресцентно-меченным гликопротеином из яичного желтка авидином, обладающим способностью практически необратимо связываться с биотином, позволяет визуализировать исследуемый участок хромосомы.По флюоресценции зондов можно быстро выявить число копий хромосомы и большие структурные перестройки хромосом в интерфазных ядрах. Интерфазная гибридизация in situ особо многообещающий метод для клиники, когда требуется получить результаты быстро, когда клетки плохо культивируются in vitro или когда отвечающая фракция клеток проявляет плохую способность к стимулируемой пролиферации, необходимой для метафазного анализа; метод позволяет также избежать ошибок в определении пола при наличии маркерной Y хромосомы. При использовании двух разных красителей, таких, как флюоресцин (желто-зеленый) и родамин (красный), можно одновременно визуализировать две разные хромосомы, например, X и Y, что значительно облегчает возможность выявления одиночных мужских клеток среди женских (при подобном двойном окрашивании можно выявить одиночную мужскую клетку среди десятков и даже сотен тысяч женских). Другой хорошо разработанный за последнее десятилетие метод — полимеразная цепная реакция (ПЦР) [34,35]. Данный метод позволяет быстро и специфично проводить анализ крайне малых количеств ДНК. При использовании ПЦР можно с помощью фермента Taq-полимеразы увеличить (амплифицировать) количество ДНК, содержащееся в одной или нескольких клетках, до количества, достаточного для пренатальной диагностики. Применив соответствующие праймеры (синтезированные искусственно участки ДНК, ограничивающие амплифицируемый регион), этим методом можно быстро установить наличие или отсутствие последовательностей ДНК, характерных исключительно для Y хромосомы. Это, например, могут быть последовательности генов SRY, ZFY. Теоретически, данный метод может выявить количество ДНК, содержащееся в одной клетке, находящейся в бесклеточной среде. В образце с другими клетками при использовании одной пары праймеров ее можно выявить среди нескольких тысяч других клеток. Для повышения чувствительности диагностики разработаны модификации метода ПЦР с применением <горячего старта> () [36] и <нестед>- праймеров [37] (в этом случае уже амплифицированная ДНК подвергается дополнительной амплификации с использованием другой пары праймеров, комплементарной последовательности, ограниченной снаружи парой первоначально примененных праймеров). С помощью этих модификаций метода ПЦР можно определить одну клетку среди сотен тысяч других. Применение описанных выше методов позволило иначе взглянуть на возникавшие ранее проблемы при пренатальном определении пола плода. Они не только значительно упростили проведение диагностики пола по клеткам амниотической жидкости и хориона, но и поставили вопрос о возможности определения пола до этапа имплантации (при оплодотворении in vitro), а также по плодному материалу, предположительно в незначительном количестве присутствующему в целомической жидкости [38,39]. Разработка методов FISH и ПЦР позволила и заново вернуться к анализу неудач при диагностике пола плода с применением неинвазивных методов получения плодного материала, в частности путем выявления клеток плода в кровотоке матери и цервикальных мазках [40-45]. Преимплантационная диагностика пола при оплодотворении in vitro проводится посредством биопсии 1-2 бластомеров от 6-8-клеточного эмбриона с последующей ДНК-диагностикой одиночных клеток [46-50]. Возможность определения пола методами FISH и ПЦР в короткие (6 ч) сроки позволяет провести имплантацию эмбриона в день взятия материала. Сочетание этих методов является более предпочтительным, так как несмотря на меньшую чувствительность, метод FISH-анализа позволяет осуществлять непосредственный визуальный контроль каждого бластомера, т.е. избегать ложных результатов, связанных с загрязнением образца в ходе манипуляций. Основной проблемой при проведении подобной диагностики является техническая сложность манипуляций с одиночными клетками, приводящая к значительному (около 25%) количеству неудачных попыток определения пола.Copyright © 2000-2005, РОО «Мир Науки и Культуры». ISSN 1684-9876
Пренатальное определение пола
Опубликовано 28.06.2007 by Беркегейм Михаил in Развитие беременности
Добавить комментарий
About Беркегейм Михаил
Я родился 23 ноября 1945 года в Москве. Учился в школе 612. до 8 класса. Мама учитель химии. Папа инженер. Я очень увлекался химией и радиоэлектроникой. Из химии меня очень увлекала пиротехника. После взрыва нескольких помоек , я уже был на учете в детской комнате милиции. У меня была кличка Миша – химик. Из за этого после 8 класса дед отвел меня в 19 мед училище. Где меня не знали. Мой отчим был известный врач гинеколог. В 1968 году я поступил на вечерний факультет медицинского института. Мой отчим определил мою профессию. Но увлечение электроникой не прошло, и я получил вторую специальность по электронике. Когда я стал работать врачом гинекологом в медицинском центре «Брак и Семья» в 1980 году, я понял., что важнейшим моментом в лечении бесплодия является совмещение по времени секса и овуляции. Мне было известно, что овуляция может быть в любое время и несколько раз в месяц. И самое главное, что часто бывают все признаки овуляции. Но ее не происходит. Это называется псевдоовуляция. Меня посетила идея создать прибор надежно определяющий овуляцию. На это ушло около 20 лет. Две мои жены меня не поняли. Я мало времени уделял семье. Третья жена уже терпит 18 лет. В итоге прибор получился. Этот прибор помог вылечить бесплодие у очень многих женщин…Обо мне
Запись на приём
+7(926) 221-14-39
Этот cайт - мой личный опыт в лечении людей. Здесь вы можете найти огромное количество статей по медицине. Я помогу решить вам ваши проблемы, создать семью, спланировать ребенка. Я много лет занимаюсь лечением бесплодия.Вы можете сами выбрать пол вашего ребенка и дату его рождения. Я помогу вам наладить отношения в семье. Лечение бесплодия в Москве не просто, однако практически все мои клиенты со временем обретают радость материнства.
Фотографии с flickr
Поиск по сайту
Категории
Мои интересы
Россия
аборт
америка
англия
антибиотик
антибиотики
беременность
бесплодие
больница
вирус
витамины
врач
гормоны
диабет
диета
женщина
иммунитет
импотенция
контрацепция
кофе
курение
лекарство
лечение
лечение бесплодия
любовь
медицина
ожирение
омоложение
операция
пересадка
питание
похудение
рак
ребёнок
роды
рф
секс
смерть
сон
сперма
сперматозоид
старение
стресс
сша
эко