Постановка иммуноферментного анализа для серодиагностики сифилисаГ.А. Киселева, В.Н. Беднова, Г.А. Дмитриев Отдел микробиологии Центрального кожно-венерологического института Минздрава РФ, Москва Показано значение иммуноферментного анализа для серодиагностики сифилиса. Изложены принцип иммуноферментного анализа и схемы его проведения в зависимости от класса выявляемых противотрепонемных антител. Указаны типы иммуноферментных тест-систем по антигену. Дана оценка результатов при проведении иммуноферментного анализа, в частности, для положительных образцов сывороток крови приведена количественная оценка результатов по титру и коэффициенту позитивности. Обозначены отечественные иммуноферментные тест-системы, разрешенные к применению в практике здравоохранения и находящиеся на разных стадиях внедрения.Ключевые слова: сифилис, иммуноферментный анализ, тест-система, антиген, антитело.  В лабораторной диагностике сифилиса ведущее место занимает серодиагностика. В нашей стране согласно Приказу Минздрава СССР N 1161 от 2 сентября 1985 г. «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» для серодиагностики сифилиса используются микрореакция (МР) преципитации с кардиолипиновым антигеном — отборочный тест; реакция связывания комплемента (РСК) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами — диагностический тест; реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ) и реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — специфические тесты. Однако МР и РСК недостаточно чувствительны при ранних и поздних формах заболевания, а также они чаще дают ложноположительные результаты. Для РИТ и РИФ используется антиген из патогенных бледных трепонем; эти реакции технически сложны, поэтому их применение ограничено рамками централизованных лабораторий.В последние десятилетия в ЦКВИ Минздрава РФ и ряде производственных предприятий разработаны методики постановки иммуноферментного анализа (ИФА), который является специфическим тестом на сифилис [1 — 5].Метод ИФА — высокочувствителен и специфичен, он рекомендуется для диагностики всех форм сифилиса и распознавания ложноположительных результатов, полученных в других серологических тестах.  Преимуществом ИФА является то, что будучи специфической реакцией он с успехом может использоваться и как скрининг-тест при массовых обследованиях на сифилис благодаря возможности автоматизации постановки и учета результатов реакции [6 — 8].  Принцип ИФА заключается в соединении комплекса антиген — антитело с конъюгатом, меченным ферментом, выявляемым с помощью субстратной смеси. В настоящее время в нашей стране тест-системы ИФА разрабатываются по трем схемам проведения реакции.  Первая схема: на твердофазном носителе (чаще лунки полистиролового планшета) фиксируется антиген возбудителя сифилиса, после чего он инкубируется с испытуемой сывороткой или плазмой крови. При наличии в этом материале от пациентов противотрепонемных антител происходит их связывание в комплекс антиген — антитело (1-я фаза реакции).  После удаления несвязавшихся иммуноглобулинов следует инкубация с меченными ферментом антителами к иммуноглобулинам человека (конъюгат), в ходе которой на поверхности носителя происходит присоединение к имеющимся комплексам антиген — антитело антител, меченных ферментом (2-я фаза). После удаления несвязавшегося конъюгата в ходе инкубации с раствором субстрата (в случае использования пероксидазного конъюгата это ортофенилендиамин, 5-аминосалициловая кислота или тетраметилбензидин в сочетании с перекисью водорода) происходит взаимодействие фермента с субстратом, в результате чего развивается цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител (3-я фаза).  Результат реакции оценивается спектрофотометрически с выводом цифровых данных, что исключает субъективность оценки, или визуально, что может быть полезно при отсутствии в лабораториях соответствующего оборудования. По такому принципу в настоящее время построено большинство тест-систем ИФА для диагностики сифилиса.  Вторая схема — ИФА с фиксированными антителами, или «ловушка для антител». Здесь на твердофазном носителе фиксируются афинно очищенные антитела к определенному классу иммуноглобулинов (M, C или A), которые находятся в испытуемых сыворотках крови (1-я фаза реакции). Образование комплекса антитело — специфический иммуноглобулин выявляют с помощью конъюгата, состоящего из антигенов бледной трепонемы, меченных ферментом (2-я фаза). При инкубации с субстратом (3-я фаза) в случае наличия сифилитических антител в испытуемой сыворотке или плазме крови наступает окрашивание раствора. В нашей стране разрабатываются подобные тест-системы для выявления противотрепонемных IgM.Третья схема ИФА используется в тест-системах для выявления суммарных антител, специфических для определения антигена, независимо от их класса. Ее суть заключается в том, что специфические сывороточные антитела одновременно взаимодействуют с антигеном, зафиксированным на твердофазном носителе, и с тем же антигеном, меченным ферментом, при совместной инкубации сыворотки крови и конъюгата (1-я фаза реакции). Наличие фермента в образовавшемся комплексе определяют с помощью субстрата (2-я фаза).  Результаты ИФА при использовании всех тест-систем с автоматическим учетом регистрируют на спектрофотометре для планшет немедленно после остановки реакции с измерением оптической плотности (ОП) раствора субстрата при длине волны 492 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень («бланк») осуществляют по воздуху. Учет результатов реакции проводят согласно методике и цифровым данным, изложенным в инструкции по применению, имеющейся в каждом используемом наборе.  При автоматическом учете результатов реакции по величине цифровых показателей ОП в лунках с испытуемыми образцами судят о концентрации специфических антител в исследуемой сыворотке крови. В связи с этим данный метод оценки результатов называют количественным. Образец сыворотки крови учитывают как положительный, если значение ОП данного образца выше критического уровня (ОПкрит), вычисляемого по формуле при осуществлении каждой постановки реакции или иным способом в соответствии с инструкциями по применению.  К сожалению, при учете результатов реакции все тест-системы ИФА невозможно привести к единому стандарту. Один и тот же образец может давать в разных тест-системах совершенно иной уровень окрашивания раствора субстрата. Это зависит от конструкции самой тест-системы, используемого антигена, концентрации конъюгата и др., а также от величины ОПкрит. Поэтому более точной оценкой результатов ИФА является титр противотрепонемных антител для каждого положительного образца. С целью определения титра производят последовательные двукратные разведения испытуемой сыворотки крови. За титр принимают наибольшее разведение сыворотки крови, дающее положительный результат. Титр является количественным показателем уровня специфических антител в данном образце и степени его позитивности.  Это имеет особое значение при оценке эффективности противосифилитического лечения, но следует учитывать, что повторное исследование сыворотки крови следует проводить с той же тест-системой.При применении тест-системы с визуальным учетом результатов также рекомендуется определение титров противотрепонемных антител в резко положительных (4+) образцах сыворотки. Титром считается последнее разведение сыворотки крови, с которым получен слабоположительный (2+) результат.Недостатком количественного метода исследования с целью определения титра антител в сыворотке крови является его неэкономичность. В этой связи АО «Вектор-Бест» предлагает другой критерий для характеристики концентрации антител — коэффициент позитивности (КП), равный отношению оптической плотности, полученной для каждого образца, к критической оптической плотности: КП=ОП/ОПкрит.  Определения КП целесообразно проводить при выяснении динамики выработки антител у пациента в процессе наблюдения за ним после лечения сифилиса, при этом обязательно нужно использовать ту же тест-систему, что и до лечения больного. Эта методика не требует финансовых затрат и дает представление об эффективности лечения.  Как при визуальном, так и при спектрофотометрическом учете результатов ИФА бывают сомнительные случаи, которые при автоматическом учете располагаются в «серой зоне» (интервал от ОПкрит — 10% до ОПкрит + 10%). Те значения ОП, которые лежат выше этой зоны, соответствуют положительному результату, а те, которые находятся ниже — отрицательному. Образцы с сомнительным результатом подлежат повторному исследованию.В настоящее время ряд предприятий осуществляет производственный выпуск оригинальных тест-систем ИФА на сифилис в виде многокомпонентных наборов, содержащих все реагенты, необходимые для проведения реакции, и инструкцию по их применению.  В зависимости от используемых антигенов все тест-системы ИФА для выявления противотрепонемных антител разделяются на: 1)    лизатные (первое поколение), в которых в качестве антигена, иммобилизованного на твердой фазе или входящего в состав конъюгата, используется нативный антиген (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре); 2)    рекомбинантные (второе поколение), в которых используются полученные генно-инженерным способом белки — аналоги определенных белковых антигенов возбудителя;3)    пептидные (третье поколение), использующие синтетические фрагменты белков.Сравнительная характеристика отечественных тест-систем ИФА на сифилис представлена в таблице.Сравнительная характеристика тест-систем ИФА на сифилисТест-системаВнедрение в медицинскую практикуХарактеристика тест-системыВид тест-системы по антигенуКласс выявляемых антителСхема проведения реакцииЧисло фаз реакцииУчет результатов«АТ-Трепонема-ИФТС» ГП «Аллерген»УтвержденаЛизатнаяIgM, IgG13Kачественный«Люис-Скрин» ЗАО «Ниармедик» и АОЗТ «Диаклон»»»IgM, IgG13Kачественный и количественный«РекомбиБест-антипаллидум» АО «Вектор-Бест»»РекомбинантнаяIgG13Kоличественный«ИФА-антитрепонема» ЗАО «Вектор-Майстар»»»IgG13»«ЭKОлаб-антипаллидум-скрин» ТОО «ЭKOлаб»»»IgG13»«РекомбиБест-антипаллидум-суммарные антитела» и «РекомбиБест-антипаллидум-суммарные антитела- стрип» АО «Вектор-Бест»В стадии утверждения»IgM, IgG32»«ИФА-АНТИ-LUES» НПО «Диагностические системы»»ЛизатнаяIgG13»«Рекомбинант-сифилис» ФАО «Ферейн»»РекомбинантнаяIgG13»«РекомбиБест-антипаллидум-IgM-стрип» АО «Вектор-Бест»В стадии разработки»IgM23»Диагностика сифилиса с помощью ИФА представляет собой эффективный метод. Необходимо более широко его использовать в виде скринингового и диагностического тестов на сифилис, но обязательным при этом должно быть высокое качество выпускаемых тест-систем. Недопустимы продажа и использование в медицинской практике тест-систем, не имеющих утвержденной фармакопейной статьи и разрешения Минздрава РФ на их применение в практике здравоохранения. Все утвержденные и рекомендованные к применению тест-системы ИФА прошли государственные испытания в ЦКВИ Минздрава РФ, который в процессе их промышленного выпуска осуществляет систематический контроль качества. К применению в медицинской практике разрешаются тест-системы, чувствительность и специфичность которых не ниже 95%.При условии выпуска стабильных высококачественных промышленных серий тест-систем, хорошо организованного контроля их качества и снабжения серологических лабораторий дерматовенерологической службы соответствующей аппаратурой возможна замена общепринятого комплекса серологических реакций на сифилис комплексом ИФА с МР преципитации с кардиолипиновым антигеном.Вестник дерматологии и венерологии, N 1-1998, стр. 39-41. Литература1.    Котровский А.В. Разработка и клиническая оценка методики постановки иммуноферментного анализа на поверхности твердофазного носителя для серодиагностики сифилиса: Дис. … канд.мед.наук. М 1986;195.2.    Бабий А.В. Клинико-серологическая оценка модифицированного иммуноферментного анализа для серодиагностики сифилиса: Дис. …  канд.мед.наук. М 1990;127.3.    Беднова В.Н., Дмитриев Г.А., Бабий А.В. и др. Новая тест-система иммуноферментного анализа для серодиагностики сифилиса. Вестн дерматол 1995;1:19 — 20.4.    Беднова В.Н., Дмитриев Г.А., Бабий А.В., Милонова Т.И. Новая тест-система ИФА на сифилис. Вестн дерматол 1994;4:51.5.    Сидорова Е.В., Ляхов В.Ф. Значение определения противотрепонемных IgM-антител в серодиагностике сифилиса. Информ. аналит. бюлл.  Заболевания, передаваемые половым путем. 1995;4:11 — 13.6.    Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передаваемых половым путем. М:Медицина 1987;303.7.    Van der Sluis J.J. Laboratoris techniques in diagnosis of syphilis. Geritourin Med 1992;68:413 — 419.8.    Larsen S.A., Steiner B.M., Rudolph A.N. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin Microbiol Ref 1995;8:1:1 — 21.РОО «Мир Науки и Культуры». ISSN 1684-9876