Лабораторная диагностика хламидийной инфекции

Представлены современные данные по микроскопии, иммунофлюоресценции, иммуноферментному методу, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и культуральному методу, применяющимся в диагностике инфицирования Chlamydia trachomatis. Методы генодиагностики (ПЦР) являются более эффективными по сравнению с традицинными (изоляция хламидии трахоматис в культуре, Е. Г. Бочкарев Институт аллергологии и клинической иммунологии, Москва Представлены современные данные по микроскопии, иммунофлюоресценции, иммуноферментному методу, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и культуральному методу, применяющимся в диагностике инфицирования Chlamydia trachomatis. Методы генодиагностики (ПЦР) являются более эффективными по сравнению с традицинными (изоляция хламидии трахоматис в культуре, иммунофлюоресценция, микроскопия, иммуноферментные методы). Недостатком ПЦР могут являться ложноположительные результаты вследствие контаминации ДНК. К ложноотрицательным результатам могут приводить наличие ингибиторов ПЦР в клинических образцах.Для достоверной диагностики хламидиоза необходим комплекс лабораторных методов, позволяющих выявить возбудителя и стадию заболевания.Ключевые слова: хламидийная инфекция, диагностика.  Многочисленные клинико-эпидемиологические иссследования свидетельствуют о широком распространении хламидий как возбудителя, передающегося преимущественно половым путем. Chlamydia trachomatis является грамотрицательным паразитирующим микроорганизмом, инфицирующим эпителий слизистых поверхностей урогенитального тракта, носоглотки и конъюктивы глаз и вызывающим их воспалительные заболевания. Эти заболевания имеют тенденцию к хронизации с развитием многочисленных осложнений [2,3,11].  Принято считать, что в 50-80% случаев нарушения репродуктивной сферы у женщин вызваны смешанными инфекциями, среди которых, кроме хламидий, наиболее часто встречаются микоплазмы и уреаплазмы [5,6,7,9].Длительное бессимптомное течение и множественные неспецифические клинические проявления затрудняют симптоматическую диагностику хламидиоза, в связи с чем основное значение приобретают лабораторные методы исследования[1,13].Проблема диагностики хламидийной инфекции становится актуальной задачей в связи с изданием Министерством здравоохранения РФ 7 декабря 1993 г. Приказа N 286 «О совершенствовании контроля за заболеваниями, передающимися половым путем (ЗППП)» и 21 февраля 2000 г. Приказа N 64 «Об утверждении номенклатуры клинических лабораторных исследований». Значительное место в Приказе N 286 отведено проблеме хламидийной инфекции, которая, наряду с сифилисом и гонореей, стала приоритетной при проведении комплекса противоэпидемических, организационных и лечебных мероприятий.  Целью настоящей работы является описание наиболее адекватных методов лабораторной диагностики хламидиоза, включенных согласно Приказу N 64 в номенклатуру клинических лабораторных исследований, определение показаний к их применению, интерпретации полученных результатов с клинической точки зрения.Техника взятия материалаОдним из самых ответственных этапов диагностики хламидиоза является забор материала. Именно этот этап должен проводиться в лечебных учреждениях широкого профиля, в то время как дальнейшая обработка материала должна осуществляться в специализированных лабораториях.  При исследовании на хламидии методом заражения культуры клеток перед взятием материала больные не должны принимать в течение месяца антибиотики тетрациклинового ряда; при цитологической методике, в том числе и при использовании моноклональных флюоресцирующих антител, антибиотики не следует применять за две недели до исследования. Перед взятием материала из уретры больные не должны мочиться в течение 1-1,5 часа.При взятии материала на хламидии следует помнить, что оптимальным для присутствия и размножения хламидий являются определенные участки цилиндрического эпителия мочеполовых путей (передняя уретра на глубине 2,5-4 cм у мужчин, слизистая оболочка цервикального канала матки на глубине 1,5 см у женщин). При взятии материала из шейки матки ключевым моментом является удаление слизистой пробки. От тщательности проведения этой подготовительной процедуры во многом зависит правильность соскоба клеток цервикального канала. Слизистую пробку удаляют ватным тампоном и пинцетом, а затем берут материал специальной щеточкой cervex brush или voba-brush, имеющей ряд преимуществ, так как для получения репрезентативного результата важно присутствие в образце клеток со всей поверхности цервикального канала, зоны трансформации [8].Достаточно информативным является исследование у мужчин осадка первой порции утренней мочи методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).Забор материала у девочек производится со слизистой оболочки преддверия влагалища, в отдельных случаях — из заднего свода влагалища через гименальные кольца. Объектом исследования на наличие хламидий могут быть смывы со слизистой оболочки глаз, носоглотки, мокрота, бронхоальвеолярный смыв.Лабораторные методы диагностики хламидийной инфекции Цитоскопические методы обнаружения хламидий. При цитоскопическом методе одновременно с поиском цитоплазматических клеток-включений Гальбершедтера-Провачека учитывается количество лейкоцитов как показателя воспаления, а также дополнительная информация о наличии сопутствующей бактериальной микрофлоры, дрожжеподобных грибов, трихомонад и т.п. 1.    Острая фаза заболевания. Материалом для исследования служат соскобы из уретры у мужчин и уретры и / или цервикального канала у женщин. Материал берут специальными щеточками или ложечками Фолькмана. Выделения из цервикального канала удаляются ватным тампоном. Щеточка вводится в канал на 1-2 см, вращается 15 секунд .  Соскобный материал распределяется на предметном стекле, высушивается на воздухе и фиксируется в метаноле или холодном ацетоне. Наиболее популярна окраска по Романовскому-Гимзе. После окраски препараты просматриваются в световом микроскопе, используя иммерсионный объектив (х90). При этом цитоплазма клеток окрашивается в голубой цвет, ядра — в фиолетово-синий, цитоплазматические включения определяются в виде темно-синих или розовых микроколоний на фоне голубой цитоплазмы. На стадии элементарных включений хламидии окрашиваются в розовый цвет, на стадии элементарных телец — в синий.  Цитоскопический метод широко доступен, но эффективен лишь при острых формах инфекции, значительно менее эффективен и информативен при хронических формах заболевания. При урогенитальном хламидиозе частота обнаружения телец Провачека в соскобах уретры и цервикального канала не превышает 10-12 %. Наличие этих телец подтверждает диагноз хламидиоза, однако их отсутствие не исключает наличие инфекции [5].Иммуноморфологические методы. Эти методы основаны на обнаружении антигенных субстанций хламидий в эпителии и других тканях путем обработки препаратов антителами. Антитела диагностической антихламидийной сыворотки соединены с какой-либо меткой — люминесцирующей (ФИТЦ-антитела) или ферментной (энзим-меченые антитела) [10].Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ). Этот метод предусматривает прямое выявление антигенов хламидий. При люминесцентной микроскопии хламидийные включения определяются в виде образований в клетке эпителия с зеленой или желто-зеленой флюоресценцией на коричнево-оранжевом фоне цитоплазмы клеток. Включения могут иметь зернистую, гомогенную или смешанную структуру.  Показаниями для диагностики хламидийной инфекции этим методом являются:1.    Острая фаза заболевания.2.    Хроническая фаза заболевания.3.    Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта.4.    Беременность при отягощенном акушерском анамнезе.5.    Бесплодие неясного генеза.Диагностическая информативность ПИФ связана с тем, что с ее помощью выявляются не только корпускулярные, но и растворимые антигены хламидий. Этот метод не зависит от возможного изменения тинкториальных свойств микроорганизма в процессе заболевания и лечения. ПИФ-метод является важнейшим скрининговым методом диагностики урогенитального хламидиоза. Его чувствительность и специфичность при использовании моноклональных антител составляет 65-90% и 85-90% соответственно. При оценке результатов следует учитывать, что только показатели флюоресценции внутриклеточных включений могут оцениваться в качестве положительного результата этого теста при использовании поликлональных антихламидийных антител. При использовании моноклональных — результат считают положительным при наличии 10 элементарных телец (ЭТ) в поле зрения или хотя бы одного внутриклеточного включения. Соскобные препараты готовят также, как и для цитоскопических исследований.  Моноклональные антитела отличаются друг от друга по яркости флюоресценции, постоянству выявляемых форм ЭТ и степени специфичности. Для диагностики хламидий этим методом необходим люминесцентный микроскоп.В целом, метод ПИФ отвечает критериям высокой чувствительности и специфичности, но требует исполнения опытным, компетентным лабораторным работником.Высококвалифицированная экспертная оценка методом ПИФ редко бывает доступной, поэтому средняя чувствительность его недостаточно высока.  Метод недостаточно чувствителен для определения малых количеств ЭТ, то есть может дать ложноотрицательные результаты [5,12].  Непрямой метод иммунофлюоресценции. Непрямой метод иммунофлюоресценции применяют в тех случаях, когда нет в наличии ФИТЦ-конъюгата антихламидийных антител. В этих случаях приготовленный тем же методом, что и для ПИФ препарат из клинических проб обрабатывают вначале антихламидийными антителами, полученными путем иммунизации хламидиями овец, кроликов, мышей или других животных, а затем второй сывороткой, специфичной для вида животного, которое было иммунизировано хламидиями. Антитела второй сыворотки конъюгированы с ФИТЦ. Показания к применению и специфичность данного метода совпадают с ПИФ.Методы иммуноферментного анализа. Эти методы основаны на обнаружении растворимого антигена хламидий в исследуемых пробах.  Чаще всего в клинической практике применяются наборы реагентов, основанные на методе твердофазного ИФА-анализа для определения антигенов хламидий. Твердая фаза покрыта хламидийными моноклональными антителами установленной специфичности. Амплификация достигается с использованием технологии полимерной конъюгации, в результате чего происходит фиксация, при которой на каждый связанный участок антигена приходится полимерный комплекс с высокомолекулярным фрагментом. Кроме того, амплификация выполняется на стадии обозначенного воспроизведения с использованием запатентованной технологии фермент-амплификации. Визуально положительные пробы окрашиваются в желто-оранжевый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна количеству антигена хламидии. Точный результат исследования определяют с помощью микроЭВМ, спектрофотометра «Мультискан» или другого аппарата для ИФА при длине волны 492 нм.  Образцы, дающие значения поглощения выше или равные значению отсекающего поглощения (cut-off), считаются положительными для хламидии. Чувствительность и специфичность ИФА методов соответственно составляет 65-70% и 90-100% . Показания к применению такие же , как и для метода прямой иммунофлюоресценции.  Выявление в сыворотке крови антител к липополисахаридному антигену хламидий класов IgG, IgA, IgM с определением их титра позволяет определить стадию заболевания, обосновать необходимость антибактериального лечения и оценить его эффективность.

Комментариев пока нет.

Добавить комментарий


Беркегейм Михаил

About Беркегейм Михаил

Я родился 23 ноября 1945 года в Москве. Учился в школе 612. до 8 класса. Мама учитель химии. Папа инженер. Я очень увлекался химией и радиоэлектроникой. Из химии меня очень увлекала пиротехника. После взрыва нескольких помоек , я уже был на учете в детской комнате милиции. У меня была кличка Миша – химик. Из за этого после 8 класса дед отвел меня в 19 мед училище. Где меня не знали. Мой отчим был известный врач гинеколог. В 1968 году я поступил на вечерний факультет медицинского института. Мой отчим определил мою профессию. Но увлечение электроникой не прошло, и я получил вторую специальность по электронике. Когда я стал работать врачом гинекологом в медицинском центре «Брак и Семья» в 1980 году, я понял., что важнейшим моментом в лечении бесплодия является совмещение по времени секса и овуляции. Мне было известно, что овуляция может быть в любое время и несколько раз в месяц. И самое главное, что часто бывают все признаки овуляции. Но ее не происходит. Это называется псевдоовуляция. Меня посетила идея создать прибор надежно определяющий овуляцию. На это ушло около 20 лет. Две мои жены меня не поняли. Я мало времени уделял семье. Третья жена уже терпит 18 лет. В итоге прибор получился. Этот прибор помог вылечить бесплодие у очень многих женщин…