Клонирование

Клонирование (в данном тексте) — метод создания клонов путем переноса генетического материала из одной (донорской) клетки в энуклиированную яйцеклетку. По всей видимости, следует различать перенос ядра эмбриональной клетки и перенос ядра соматической клетки взрослого организма.
(Обзор литературы)
П.А.Гоголевский, В.М.Здановский
Московский центр по лечению бесплодия ЭКО; кафедра акушерства и гинекологии N1 лечебного факультета РГМУ, Москва Проблемы репродукции, N3-1998, с.11-16 Представлены основные этапы научных исследований, зарождения и восприятия идеи клонирования в современном мире, возможные области применения и технологии клонирования человека.
Ключевые слова:
клон, клонирование, энуклеация, импритинг, геном, митохондрии, трансгенные животные.
Словарь
Клон — совокупность клеток или организмов, генетически идентичных одной родоначальной клетке.
Клонирование (в данном тексте) — метод создания клонов путем переноса генетического материала из одной (донорской) клетки в энуклиированную яйцеклетку. По всей видимости, следует различать перенос ядра эмбриональной клетки и перенос ядра соматической клетки взрослого организма.
Энуклеация — методы, включающие полное удаление ядерного материала из яйцеклетки.
Импринтинг — зависимость экспрессивности гена от того, каким родителем он передан. Одним из механизмов импринтинга является изменение уровня метилирования ДНК. Тотипотентность — свойство клетки реализовывать генетическую информацию ядра, обеспечивающую развитие до целостного организма. Тотипотентная клетка способна дифференцироваться в любую ткань или специализированную клетку.
Митохондриальный геном — кольцевая ДНК около 16,5 тыс. пар нуклеотидов, содержащаяся в цитоплазматических органелах — митохондриях. Общее количество митохондриальной ДНК по сравнению с ядерной менее 1%. Как правило, наследуется по материнскому типу. Трансгенные животные — животные, несущие в своем геноме стабильно интегрированную рекомбинантную генную конструкцию (трансген). В последнее время, после сообщения британских ученых о появлении на свет овцы, генетически идентичной другому животному, но не являющейся ему однояйцовым близнецом и существенно отличающейся от него по возрасту, во всем мире начались оживленные дебаты, касающиеся различных аспектов клонирования млекопитающих. Особенно остро дискутируется эта тема в связи с существующей (пока что, правда, теоретически) возможностью клонирования человека. Средствами массовой информации обсуждаются этические, юридические, религиозные, психологические и другие (порой самые невероятные) проблемы, которые могут возникнуть при внедрении в практику такого способа воспроизводства человека.
Не остались в стороне от решения вопроса: и российская печать и телевидение. Однако, как можно судить по высказываниям ведущих телевизионных программ, авторов публикаций и других участвующих в препарировании этого сенсационного материала, складывается впечатление о недостаточно глубоком знании и понимании как самой сущности метода клонирования, так и, следовательно, последствий его возможного использования в будущем. В то же время серьезность поставленного вопроса не вызывает сомнений. Поэтому, учитывая уникальность журнала в смысле тематики публикаций, достаточно широкий круг его подписчиков, которыми помимо специалистов-репродуктологов, являются и врачи других специальностей, а также желание поделиться данными, почерпнутыми в зарубежной литературе, мы сочли небезынтересным для читателя представить на этих страницах некоторые сведения о клонировании животных.
Сначала хотелось бы привести общеизвестный пример естественного клонирования, существующего в природе, имеющего место и у человека — однояйцовые близнецы, развившиеся из одной яйцеклетки. Это всегда только оба мальчика или обе девочки и всегда удивительно похожие друг на друга.
Известно также, что эмбрион млекопитающего (в том числе и человека) на самых ранних стадиях (у человека по крайней мере до стадии 8 бластомеров) может быть без видимых отрицательных последствий разделен на отдельные бластомеры, из которых при определенных условиях могут развиться идентичные по своему генотипу особи, по аналогии с однояйцовыми близнецами. То есть из одного 8-клеточного эмбриона у человека можно получить до 8 абсолютно идентичных девочек или мальчиков. Однако, что они будут представлять собой, когда родятся и вырастут? Это вопрос! Скорее всего они будут мало различаться внешне, но условия внутриутробного развития, воспитания, внешней среды, конечно, наложат определенный отпечаток. В практике, основанной на оплодотворении in vitro, культивировании и переносе эмбрионов в матку (хотя это и представляет какой-то интерес), разделение эмбриона на бластомеры и их выращивание у человека не получили признания, с одной стороны, из-за отсутствия в этом необходимости, а с другой — из-за сложности самой процедуры. Следует отметить, что приведенные примеры, несмотря на то, что могут соответствовать понятию , не отвечают термину (см. словарь).
Введение
Шестьдесят лет назад немецкий эмбриолог, лауреат Нобелевской премии Ганс Шпеман (Spemann) впервые поставил вопрос о целостности и идентичности генома в течение всей жизни организма. Он же предложил эксперимент по переносу ядра какой-нибудь дифференцированной клетки в яйцеклетку с предварительно разрушенным собственным ядром. Совместно с Дришем (Driesch) он впервые показал, что ядра ранних эмбрионов морских ежей и тритонов тотипотентны, т.е. способны обеспечивать развитие любых типов клеток. Естественно встал вопрос, действительно ли рост, развитие и дифференциация эмбриона затрагивают необратимые модификации генома в соматических клетках.
Ниже приведены некоторые сведения об экспериментальном клонировании животных, отраженные в литературе.
Так, эксперименты, начатые в 1952 г. и проведенные на амфибиях, показали, что из ядер, полученных из клеток ранних эмбрионов, можно клонировать взрослый организм. Однако ядра клеток взрослого животного могли развиваться только до стадии головастика и не могли создавать взрослого клона [2,7,8].
Пересадка ядер у млекопитающих впервые была предпринята на мышах в 1983 г. Более 90% реконструированных зигот мыши, получивших пронуклеусы от других зигот, успешно достигали стадии бластоцисты. Однако когда переносили ядра из 4-, 8-клеточных эмбрионов или ядра внутренней клеточной массы в энуклиированные яйцеклетки, ни одна зигота не достигала стадии бластоцисты [5,9,17]. Опыты по клонированию других видов млекопитающих методом переноса ядер эмбриональных клеток имели определенный успех, и были получены клоны овцы, коровы, кролика, свиньи, козы [1,10,16,21]. Причем первые клонированные овцы родились после переноса ядер 8- 16-клеточных эмбрионов [20]. Потомство у коров и овец было получено также после переноса ядер тотипотентных клеток короткоживущей клеточной культуры, полученной из ранних преимплантационных эмбрионов [13,14].
Перенос ядер эмбриональных клеток можно осуществлять между близкородственными видами, например между M.musculus и M.caroli [14-a]. В то же время на последней ежегодной встрече 1997 г. Международного общества по переносу эмбрионов (International Embryo Transfer Society) в Бостоне исследователи из Университета Висконсия-Мадисон сообщили об успешном клонировании 70 эмбрионов при использовании энуклиированных яйцеклеток коров и ядер от эмбриональных клеток овец, свиней, крыс и обезьян. Реконструированные эмбрионы культивировали до 60-120-клеточной стадии. Однако не было получено ни одной беременности после переноса эмбрионов.
В 1997 г. Рослинский институт совместно с биотехнологической компанией PPL Therapeutics объявили о клонировании 5 овец с помощью переноса ядер клеток фибробластов плода, в которые предварительно были введены искусственно созданные генетические конструкции. Две полученные таким образом трансгенные овцы несли ген фактора свертываемости крови IX человека. Предполагается, что данный высокоценный белок будет экспрессироваться с молоком овец. Таким образом, интеграция чужеродной ДНК в геном фибробластов не нарушила , которая контролирует эмбриональное развитие овец [4, 11, 12].
Оригонский региональный исследовательский центр по изучению приматов сообщил о клонировании двух обезьян при использовании ядер клеток эмбриона на стадии дифференцировки [3]. Американская биотехнологическая компания ABS Global Inc. сообщила о рождении в феврале 1997 г. бычка, полученного с помощью технологии клонирования и с использованием ядер первичных стволовых клеток 30-дневного эмбриона [18].
Все приведенные выше работы были выполнены с помощью переноса ядер эмбриональных недифференцированных или частично дифференцированных клеток плодов и эмбрионов и считалось, что получить клон с использованием ядра полностью дифференцированной клетки взрослого организма невозможно.
Та самая Долли
Наибольший резонанс общественности, в том числе и научной, вызвала работа Уилмута (Wilmut) с коллегами, появившаяся в февральском номере Nature за 1997 г. Это единственная на сегодняшний день опубликованная научная статья, посвященная получению живого потомства после переноса ядра, взятого из соматической клетки взрослого животного.
Вкратце результаты этой работы таковы. Были получены три новые клеточные популяции из клеток 9-дневных преимплантационых эмбрионов, 26-дневных плодов и клеток молочной железы 6-летней овцы. Ядра из данных клеток переносили в предварительно энуклиированные неоплодотворенные ооциты овцы. С помощью электропорации стимулировали слияние кариопласта с цитоплазмой и активацию ооцита. Реконструированные таким образом ооциты культивировали in vivo до стадии морула/бластоциста и переносили суррогатным овцам — реципиентам. Из 834 удачно реконструированных ооцитов было получено 8 живых ягнят, причем из 277 ооцитов, в которые переносили ядра клеток взрослого животного, получена только одна — знаменитая Долли [19].
Развитие эмбрионов, созданных путем переноса ядер, в первую очередь зависит от сохранения плоидии реконструированного эмбриона и создания условий, необходимых для нормальной регуляции экспрессии генов во времени и пространстве. Основополагающим фактором, по всей видимости, является стадия клеточного цикла донора и реципиента и взаимодействие между ними.
Так, если ядра клеток, находящихся на стадии S или G2, переносят в ооциты, находящиеся на стадии МII, они имеют тенденцию проходить дополнительную ДНК-репликацию и преждевременную конденсацию хромосом, что ведет к анеуплоидии и аномальному развитию реконструированного ооцита [6]. Уилмут преодолел эту проблему с помощью трансплантации ядер из клеток, которые были блокированы на стадии G0 диплоидной фазы путем истощения содержания сыворотки в культуральной среде. Перенос ядер на этой стадии лучше с цитоплазмой ооцита, уменьшая случаи хромосомных аномалий. Этим можно объяснить существующие трудности в клонировании мышей: ядра эмбриональных клеток в ранней преимплантационной стадии в основном находятся в S и G2, и очень трудно (или почти невозможно) блокировать эмбриональные стволовые клетки на стадии G0 путем истощения сыворотки.
Другими факторами, которые могли влиять на успешный исход работы Уилмута, являются 1) большая доступность хроматина (за счет деспирализации ДНК) из клеток на стадии G0 ооцитарному ремоделирующему фактору/факторам; 2) начало транскрипции эмбрионального генома овцы на 8-16-клеточной стадии (у тех же мышей начало транскрипции происходит уже на поздней двуклеточной стадии). Теоретически такая поздняя активация генома позволяет эмбриону овцы в течение, по крайней мере, двух клеточных циклов репрограммировать и ремоделировать ДНК трансплантированного ядра взрослой клетки. Если последний аспект действительно играет значительную роль в данном эксперименте, будет очень трудно воспроизвести результаты клонирования на других видах млекопитающих, у которых активация эмбрионального генома происходит на более ранних стадиях, чем у овцы [15].
Своей работой Уилмут с коллегами продемонстрировали, что ядра клеток молочной железы взрослой овцы могут быть при определенных условиях репрограммированы цитоплазмой ооцита и дать развитие новому организму. Полученные данные заставили по-новому посмотреть на процесс клеточной дифференциации. Этот процесс, как оказалось, не носит необратимый характер. Совершенно ясно, что цитоплазматические факторы способны инициировать развитие нового организма на основе генетического материала ядра взрослой полностью дифференцированной клетки. Таким образом, биологические часы могут быть повернуты вспять, и развитие организма может начаться из генетического материала взрослой дифференцированной клетки, что полностью противоречит ранее общепринятой биологической догме.

Комментариев пока нет.

Добавить комментарий


Беркегейм Михаил

About Беркегейм Михаил

Я родился 23 ноября 1945 года в Москве. Учился в школе 612. до 8 класса. Мама учитель химии. Папа инженер. Я очень увлекался химией и радиоэлектроникой. Из химии меня очень увлекала пиротехника. После взрыва нескольких помоек , я уже был на учете в детской комнате милиции. У меня была кличка Миша – химик. Из за этого после 8 класса дед отвел меня в 19 мед училище. Где меня не знали. Мой отчим был известный врач гинеколог. В 1968 году я поступил на вечерний факультет медицинского института. Мой отчим определил мою профессию. Но увлечение электроникой не прошло, и я получил вторую специальность по электронике. Когда я стал работать врачом гинекологом в медицинском центре «Брак и Семья» в 1980 году, я понял., что важнейшим моментом в лечении бесплодия является совмещение по времени секса и овуляции. Мне было известно, что овуляция может быть в любое время и несколько раз в месяц. И самое главное, что часто бывают все признаки овуляции. Но ее не происходит. Это называется псевдоовуляция. Меня посетила идея создать прибор надежно определяющий овуляцию. На это ушло около 20 лет. Две мои жены меня не поняли. Я мало времени уделял семье. Третья жена уже терпит 18 лет. В итоге прибор получился. Этот прибор помог вылечить бесплодие у очень многих женщин…