Представлен новый метод определения основных показателей фертильности спермы с помощью разработанного спермоанализатора. В основе метода — анализ частотного спектра флуктуаций оптической плотности образца сперматозоидов, вызванных их движением через оптический канал со специальными характеристиками. З.А. Габбасов*, Г.В. Тер-Аванесов**
Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ РФ*, Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН**, Москва
Проблемы репродукции, 2-1999, с.67-70
Представлен новый метод определения основных показателей фертильности спермы с помощью разработанного спермоанализатора. В основе метода — анализ частотного спектра флуктуаций оптической плотности образца сперматозоидов, вызванных их движением через оптический канал со специальными характеристиками. Результаты исследований указывают, что предложенный метод адекватно и корректно отражает основные показатели подвижности и концентрацию сперматозоидов. Спермоанализатор позволяет исследовать сперму в нативной среде.
Ключевые слова:
сперматозоиды, подвижность, концентрация, фертильность.
Интерес, возросший за последнее время к проблеме мужского бесплодия, обусловлен высокой частотой нарушений репродуктивной функции мужчин, составляющей в бесплодном браке 40-50%. Важнейшим методом в оценке функционального состояния половых желез и суждении о плодовитости мужчин является исследование спермы. В связи с этим, выявление мужского фактора при обследовании бесплодных пар в большой степени зависит от точного и корректного определения показателей подвижности и концентрации сперматозоидов в семенной жидкости [1, 2]. Эти данные являются основными дискриминационными показателями и решающими в оценке ее фертильности [3, 4]. Признание значимости объективного определения характеристик подвижности клеток привело к созданию различных методических подходов и устройств, позволяющих вычислять их подвижность и концентрацию. Среди них, имеющие приоритетное значение, компьютерные системы анализа семенной жидкости, включающие микроскоп и видеокамеру с цифровой обработкой изображений. Эти устройства являются весьма дорогостоящими и требуют применения сложных алгоритмов обработки больших массивов данных [5, 6]. Высокая стоимость приборов, большая продолжительность выполнения анализа и не всегда отвечающая полным требованиям оценки анализа воспроизводимость результатов являются постоянными объектами критики таких систем.
К разряду нетрудоемких и недорогих подходов, позволяющих быстро провести качественный анализ спермы, относится определение коэффициента подвижности сперматозоидов [7]. Метод регистрирует флуктуации оптической плотности, вызванные движением сперматозоидов через тонкий оптический канал. Частота этих флуктуаций коррелирует с концентрацией подвижных клеток и интенсивностью их движения, что используется для вычисления коэффициента подвижности сперматозоидов. Однако, вопрос применимости этого параметра в клинической практике остается открытым. Также нерешенными остаются вопросы стандартизации измерений. Это в первую очередь касается температурного режима, типа камеры и состава среды для разведения образцов.
Развитие оптических методов позволило создать новые подходы к оценке характеристик подвижности сперматозоидов. Для определения основных показателей фертильности спермы в неразбавленном эякуляте нами был разработан принципиально новый метод. Он позволяет регистрировать концентрацию, суммарную подвижность, количество активно подвижных и среднюю скорость сперматозоидов. Целью настоящей работы явилось изучение возможности применения нового метода и разработанного спермоанализатора для оценки качества спермы в сравнении с данными, полученными при использовании камеры Маклера в оптическом микроскопе.
Материал и методы
Проведено исследование спермы у 74 мужчин, состоящих в бесплодном браке с нормо- и патозооспермией. Клинико-лабораторное исследование выполняли под контролем врача-андролога. Для интерпретации полученных результатов и оценки их информативности использовали данные, изложенные в Руководстве ВОЗ по лабораторному исследованию спермы человека и взаимодействию с цервикальной жидкостью, рекомендованные для практического применения (1992 г.).
Анализ спермы осуществляли при половом воздержании не менее 3-х дней и не больше 7 дней. Сбор спермы производили в стерильный пластмассовый контейнер, ранее проверенный на токсичность к сперматозоидам. Все манипуляции с хранением и транспортировкой образцов осуществляли при температуре 22-26њС. Исследование спермы выполняли в камере Маклера при 200-кратном увеличении микроскопа в течение 1 часа после сбора образца. Скорость движения клеток определяли по времени, необходимому для преодоления расстояния 0,1 мм.
Образцы спермы параллельно исследовали с помощью разработанного нами устройства, принципиальная схема которого показана на рис. 1а. Хорошо перемешанная проба с помощью микропипетки объемом 50 микролитров помещалась в специальную стеклянную камеру, где под действием капиллярных сил она заполняла рабочий объем. При движении клеток в камере возникали периодические колебания оптической плотности с частой, соответствующей скорости перемещения клеток и периоду модуляции интенсивности света (рис. 1б). Колебания интенсивности света, которые регистрировались фотоприемником, поступали в аналогоцифровой преобразователь и далее в компьютер. Так как интенсивность света вдоль рабочей поверхности камеры была модулирована периодической функцией с периодом модуляции 15 мкм, то после спектрального анализа сигнала по его мощности в соответствующем диапазоне частот вычисляли количество клеток, имеющих определенную скорость. Анализ флуктуаций оптической плотности, вызванных движением клеток через оптический канал, позволил вычислить их концентрацию в образце. Как известно, этот принцип использовался ранее для определения концентрации клеток крови [8].

Рис. 1. Схема прибора.
Анализ спермы проводили в специальной камере, температура которой поддерживалась при 37њС. Для свободного движения сперматозоидов в камере и создания возможности регистрации гиперактивных клеток глубина камеры была выбрана достаточно большой (200 мкм). Так как в основном клетки двигались параллельно стенкам, то корректировать результаты анализа их подвижности с учетом третьего измерения, то есть перпендикулярно стенкам камеры, не требовалось.
Концентрацию сперматозоидов определяли в млн/мл, а подвижность в % от их общего числа, как это принято в руководстве ВОЗ (1992 г.). Устройство надежно фиксировало параметры сперматозоидов в широком диапазоне концентраций (2-250 млн/мл). При этом регистрировались сперматозоиды, имеющие скорость движения 2- 150 мкм/сек, а общее время измерения составляло 4,5 минуты.
Определяемые величины представлены как среднее среднеквадратичное отклонение. Для оценки корреляции между стандартными методами анализа и показаниями прибора использовался непараметрический анализ Пирсона.
Результаты и обсуждение
Существует большое разнообразие факторов, прямо или косвенно влияющих на точность того или иного метода диагностики. В связи с этим, создание новых технологий предусматривает не только исследование стандартизированных методик, но и повышение контроля качества и точности проводимых процедур, позволяющих дать возможность накапливать и сопоставлять информацию. Примером этого является прогресс в области исследования спермы. С момента первого издания Руководства ВОЗ по лабораторной оценке спермы в 1980 г. были предложены и модернизированы на более простые и удобные различные тесты диагностики спермы: от специализированных гемоцитометрических камер (R.Neubauer и А.Makler) до современных автоматических компьютерных систем (CASA). Естественно, каждое такое устройство не может быть , и все зависит от того, какую задачу ставит исследователь перед данной системой. Разрабатывая новый методический подход для анализа спермы, авторы исходили из задачи создания простого и удобного метода, преимуществом которого была бы высокая точность и воспроизводимость получаемых результатов в широком диапазоне концентраций клеток, характерных для нативного эякулята.

Copyright © 2000-2002, РОО «Мир Науки и Культуры». ISSN 1684-9876