Перспективы совершенствования лабораторной диагностики бессимптомных форм гонореи На современном этапе развития медицина сталкивается с рядом серьезных проблем, связанных с качественными и количественными изменениями инфекционной заболеваемости человека.Перспективы совершенствования лабораторной диагностики бессимптомных форм гонореи На современном этапе развития медицина сталкивается с рядом серьезных проблем, связанных с качественными и количественными изменениями инфекционной заболеваемости человека. В частности, с резким, и, в известной степени, неконтролируемым ростом случаев инфицирования Neisseria gonorrhoae, которые только по опубликованным данным зарубежных официально признанных научных изданий варьирует в пределах 14-29,2% в определенной зависимости от пола больных (2, 3, 9).
В основе, как полагают, могут лежать значительное снижение иммунореактивности (5), само- и/или неэтиотропное лечение и, конечно же, селекция антибиотикоустойчивых особей популяции возбудителя. Так, показано, что на фоне интенсивной химиотерапии in vivo происходит естественный отбор штаммов, отличающихся исключительно высоким уровнем резистентности. Установлено, что уже через 3 недели лечения эритромицином минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для штаммов N.gonorrhoae, выделенных до начала лечения и по окончании курса терапии возрастает с 1 мг/л до 3 мг/л, а азитромицина — с 0,125 до 3 мг/л, т.е. в 24 раза. Это, по ряду публикаций, может носить сочетанный характер (4, 11). Не исключена вероятность для N.gonorrhoae существования в виде некультивируемых форм возбудителя (1). Как возможные следствия изложенного рассматривают изменение характера симптоматики и увеличение относительного числа атипичных, бессимптомных и стертых форм заболевания, в особенности среди женщин. Так, инкубационный период гонореи в настоящее время в 86,2% случаев превышает 14 дней, что не согласуется с общепринятыми представлениями о клинике указанного заболевания. Дизурия у больных фиксируется лишь в 33-52,8% случаев лабораторно подтвержденной гонореи. В 10,2% заболевание, по литературным данным, протекает при полном отсутствии соответствующих патогномоничных признаков (6-8, 10).
Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явился анализ случаев бессимптомной, латентной гонореи, и, в частности, вопросов касающихся изменения морфологии возбудителя и перспектив совершенствования лабораторной диагностики заболевания.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Проанализировано 10 случаев (5 женщин и 5 мужчин), при которых хроническая гонорея была заподозрена анамнестически у одного из половых партнеров, при абсолютном отсутствии у обследованных патогномоничной симптоматики. Вышеизложенное послужило основанием для дополнительного лабораторного исследования с включением в сферу внимания каждого из них.
Исследуемый материал:
Соскобы слизистой уретры и влагалища, осуществлялись при использовании одноразовых зондов (Швеция).
Световая микроскопия (СМ):
Материал наносили на обезжиренные стекла фирмы «Ниармедик +» (г.Москва), отличающиеся от обычных исключительным качеством шлифовки и стандартной толщиной пластины, что существенно облегчало процесс фокусировки на микроскопе «ЛЮМАМ Р-1». Увеличение 350-500 раз.
Препараты фиксировали «щадящим» химическим методом, обеспечивающим сохранение ультраструктуры соскоба крайне необходимым при микроскопической диагностике хронических форм патологии. Окрашивали стандартным методом Грама и метиленовой синью в модификации кафедры микробиологии БГМУ (пропись не раскрывается ввиду оформления соответствующей патентной документации). Микрофотосъемку осуществляли на кафедре гистологии БГМУ на микроскопе фирмы «Karl Ceiss Iena» (Германия) при техническом содействии доцента кафедры — Мурзабаева Х.Х.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР):
Верификацию результатов проводили при использовании техники ПЦР.
Забор исследуемого материала.
Осуществлялся в специальные пробирки типа «Eppendorf», содержащие соответствующую буферную смесь.
Режим амплификации.
Денатурация — 93,0оС
«Отжиг» праймеров — 60,0оС
Амплификация — 72,0оС
Количество циклов — 35.
Анализ ДНК.
10 мкл реакционной смеси после амплификации анализировали электрофоретически в 1,5% агарозном геле. В качестве маркёров использовали ДНК фага ?, рестрицированную Bst E2, и положительный контроль ДНК N.gonorrhoae. ДНК окрашивали бромидом этидия и фотографировали при освещении ультрафиолетовыми лучами (494 нм) на трансиллюминаторе.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Зарубежные литературные данные свидетельствуют, что даже при хронической гонорее выявляемость возбудителя в мазках-препаратах может достигать 81,1%, но существенно зависит от вида исследуемого материала, значительно снижаясь, например, при анализе ректальных проб (3).
В результате проведенного нами сравнительного изучения клинических образцов были установлены 2 основных морфоварианта (Рис.1 и Рис.2), наблюдаемые при световой микроскопии мазков женщин (Рис.1) и мужчин (Рис.2).
При этом показано, что у женщин в 3 из пяти случаев микроскопически обнаруживалась картина бактериального вагиноза (БВ), практически исключавшая возможность визуальной детекции диплококков (Рис.1) ввиду обилия сопутствующей грамвариабильной бактериальной флоры. Это с одной стороны могло быть связано со значительным снижением естественной резистентности слизистой, а с другой стороны — с угнетением жизнеспособности патогенов гнилостной флорой ввиду их высокой физиологической зависимости от организма хозяина, лежащей в основе способности возбудителя к факультативному внутриклеточному паразитированию.
Рис.1. Микроскопическая картина БВ (увеличение х 350) Сравнительная характеристика проб, окрашенных различными способами, в процессе их световой микроскопии показала полную непригодность в анализируемых случаях метода Грама, поскольку делала практически невозможной дифференциацию грамположительных и грамотрицательных бактерий. Объяснение указанному, на наш взгляд, следует искать в том факте, что микроорганизмы заселяющие определенную экологическую нишу в естественных условиях принадлежат к различным «возрастным» группам. В этом случае клеточная стенка бактерий, включая пептидогликан, находится на разных этапах формирования и не всегда содержит химические вещества необходимые для прочного их связывания с генцианвиолетом и/или фуксином. В указанных случаях также необходимо учитывать давление на микроб внешних факторов (антибиотики, дезинфектанты, гормональный фон больного, уровень его иммунореактивности и.д.), каждый из которых может существенно изменить физиологическое и морфологическое состояние возбудителя. Предложенная же нами модификация метода окраски метиленовой синью позволяла дифференцировать грамвариабельные формы бактерий, очевидно благодаря участию в окрашивании иных химических групп, что требует, однако, дальнейшего научного осмысления.
Рис.2. Микроскопическая картина мазка больной хронической атипичной формой гонореи, верифицированной методом ПЦР (увеличение х 350). Считается, что при хронической гонорее информативность СМ повышается только в период рецидива заболевания или же при суперинфицировании больного. Вместе с тем, проведенные нами исследования показали, что выявляемость диплококков может быть связана с адекватностью восприятия обнаруживаемых фактов. Так в 7 из 10 случаев микроскопически установлена картина, не укладывающаяся в рамки общепринятых представлений о пейзаже мазков, выявляемых при СМ у больных даже хроническими формами гонореи (Рис. 2), поскольку ни в одном из них мы не обнаружили «привычного», с точки зрения отечественной литературы, лейкоцитоза. Во всех 7 положительных по СМ образцах возбудитель, не имея четкой бобовидной формы, был окружен мощной капсулой, соизмеримой с размерами клетки в целом, дифференцировался как грамотрицательный, присутствовал практически в чистой культуре, но отличался меньшими (в 2 и более раза) размерами. Это требовало увеличения разрешающей способности микроскопа (не менее х350-500 раз), создавая одновременно проблемы, связанные с необходимостью повышения интенсивности освещения.
Рис.3. Фотоснимок агарозного геля с результатами ПЦР по амплификации специфических фрагментов ДНК N.gonorrhoae (Банды 1-4 (ДНК фага l и N.gonorrhoae — положительные контроли, банды 5-14 — исследованные образцы).
Изложенные выше данные, тем не менее, не позволили нам делать серьезные научные обобщения, и послужили мотивацией к верификации полученных результатов при использовании самого современного метода диагностики — полимеразной цепной реакции. Осуществленный в соответствии с требованиями забор исследуемого материала и подготовка образцов позволили нам откорректировать первоначальные результаты и дополнительно выявить случай хронической гонореи в ситуации, когда микроскопически соответствующий результат нам зафиксировать не удалось даже после соответствующих провоцирующих воздействий. При этом, благодаря ПЦР ложноотрицательный результат был исключен у женщины даже на фоне БВ, когда вероятность диагностической ошибки наиболее высока. Более того, было показано, что метод применим для выявления атипичных и, возможно, некультивируемых форм возбудителя, являющихся наиболее частыми при хронических и атипичных формах инфекционного процесса. Это делает его незаменимым на этапе контроля излеченности и требует более широкого внедрения благодаря исключительно высокой чувствительности. Таким образом, при исследовании клинического материала у одной из обследованных пар лабораторный диагноз был снят, тогда как в четырех случаях методом ПЦР результат был подтвержден у обоих половых партнеров на фоне отсутствия соответствующей симптоматики. Резюмируя вышеизложенное, следует заключить, что гонорея в современных условиях претерпела существенные изменения, обусловливая возникающие на практике сложности диагностики указанных форм патологии человека, а как следствие этого — проблемы с осуществлением этиотропной терапии. В этой связи возникает необходимость пересмотра диагностических подходов в плане совершенствования традиционных методов и внедрения новых, также изменения отношения к получаемым лабораторным данным в процессе их интерпретации.
ВЫВОДЫ
БВ должен рассматриваться как фактор, определяющий вероятность диагностических ошибок.
Микроскопически продемонстрирована специфика морфологической картины, выявляемой при подозрении на хроническую гонорею. Полимеразная цепная реакция обеспечивает объективный результат при атипичных и хронических формах гонореи.
ЛИТЕРАТУРА
Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Генетический контроль индукции некультивируемого состояния у патогенных бактерий.// Журн.микробиол.- 1996, №3.- С.16-18. Alary M., Laga M., Vuylsteke B., Nzila N., Piot P. Signs and symptoms of prevalent and incident cases of gonorrhea and genital chlamydial infection among female prostitutes in Kinshasa, Zaire.// Clin.Infect.Dis.- 1996.- V.22, N3.- P.477-484.) Crotchfelt K.A., Welsh L.E., De Bonville D., Rosenstraus M., Quinn T.C. Detection of Neisseria gonorrhoae and Chlamydia trachomatis in genitourinary specimens from men and women by a coamplification PCR assay.// J.Clin.Microbiol.- 1997.- V.35, N6.- P.1536-1540. Ehret J.M., Nims L.J., Judson F.N. A clinical isolate of Neisseria gonorrhoae with in vitro resistance to erythromycin and decreased susceptibility to azithromycin.// Sex.Transm.Dis.- 1996.- V.23, N4.- P.270-272.
Hauck C.R., Lorenzen D., Saas J., Meyer T.F. An in vitro-differentiated human cell line as a model system to study the interaction of Nesseria gonorrhoae with phagocytic cells.// Infect.Immun.- 1997.- V.65, N5.- 1863-1869. Madjar S., Nativ O., Barbara J., Tal J., Potasman I., Srugo I. Diagnostic and therapeutic approach to sexually transmitted diseases.// Harefuah.- 1996.- V130, N12.- P.811-814. Madjar S., Nativ O., Barbara J., Tal J., Potasman I., Srugo I. Diagnostic and therapeutic approach to sexually transmitted diseases.// Harefuah.- 1996.- V130, N12.- P.879. Madjar S., Nativ O., Barbara J., Tal J., Potasman I., Srugo I. Diagnostic and therapeutic approach to sexually transmitted diseases.// Harefuah.- 1996.- V130, N12.- P.880. Schwebke J.R., Sadler R., Sutton J.M., Hook E.W.-3rd. Positive screening tests for gonorrhoae and chlamydial infection fail to lead consistently to treatment of patients attending a sexually transmitted disease clinic.// Sex.Transm.Dis.- 1997.- V.24, N4.- P.181-184.
Sherrard J., Barlow D. Gonorrhoea in men: clinical and diagnostic aspects.// Genitourin.Med.- 1996.- V.72, N6.- P.422-426. Young H., Moyes A., McMillan A. Azithromycin and erythromycin resistant Neisseria gonorrhoae following treatment azithromycin.// Int.J.STD.AIDS.- 1997.- V.8, N5.- P.299-302.
АВТОРЫ
А.Р.Мавзютов, З.Г.Габидуллин, Э.Д.Ахунов, М.М.Туйгунов, Д.Т.Гашимова, А.К.Булгаков, З.Р.Хисматуллина, В.З.Галимзянов.

© Copyright by MedInfoNet
Design by
© Crystal Design